非肌層浸潤性膀胱癌環狀RNA表達譜及生物信息學分析

何宇輝 ，鄧益森 ，彭畔新 ，王愛軍 ，張曉云 ，李俊杰 ，周曉峰 ，2?

（1.中日友好醫院 泌尿外科，北京 100029；2.北京大學中日友好臨床醫學院，北京 100029）

膀胱癌是泌尿系統中最常見的惡性腫瘤。據統計[1]，膀胱癌的發病率居惡性腫瘤的第十一位，在男性惡性腫瘤中排第七位。其中有將近70%的膀胱癌患者是非肌層浸潤性膀胱癌（non-muscle-invasive bladder cancer，NMIBC）[2]。 膀胱癌經不同方法治療后，根據所處的不同風險分組，5年的復發率在30%～80%，其中約15%的低級別腫瘤復發為高級別腫瘤[3]。吸煙和長期接觸工業化學產品是兩大可能致病因素。

環狀RNA（circRNA）是一類不同于線性RNA的環形RNA分子，大多由RNA的3'端和5'端共價閉合而成環。環狀RNA通常不具有ployA尾，對核酸外切酶不敏感，穩定性要強于普通的線性RNA分子，半衰期也要遠長于一般的RNA分子[4]，因此環狀RNA在未來可以作為一種潛在生物分子標記物[5]。研究表明circRNA與腫瘤的發生發展有密切的關系[6]，一些circRNA可通過序列上存在的miRNA結合位點吸附于miRNA，起分子海綿作用，調控相應的靶基因[7]，是目前circRNA研究領域的熱點。對于circRNA是如何調控NMIBC的發生及發展，目前還有待進一步研究。

本研究應用Illumina測序技術分別對5例NMIBC患者的癌組織及癌旁正常組織中表達的circRNA進行檢測，通過對原始數據進行均一化處理后，篩選出差異表達的circRNA，并運用生物信息技術對差異表達的circRNA集合的來源基因做注解及基因本體論（GO）分析，根據差異表達的circRNA序列對其可能的靶向miRNA進行預測，為研究NMIBC發病機制及尋找潛在的生物標志物奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 標本收集

5例NMIBC患者癌組織及癌旁組織來自2016年2～6月在中日友好醫院進行手術治療的膀胱腫物患者，標本從術中采集并即刻放入非凍型組織RNA保存液（SolarbioR）并轉移至-80℃冰箱保存待測。所有患者的腫物組織標本術后病理均證實為NMIBC。本研究經中日友好醫院倫理委員會審核通過，標本的采集均經過家屬授權并簽署知情同意書。

1.2 RNA提取與circRNA芯片檢測

使用Trizol試劑提取總RNA，1%的瓊脂糖電泳檢測RNA樣品是否有降解以及雜質，使用凱奧K5500分光光度計檢測樣品純度。用Ribo-Zero Gold Kits去除樣品中的rRNA，根據NEB Next Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina（NEB，Ispawich，美國）的操作說明進行建庫。構建好的文庫送至博淼生物科技（北京）有限公司進行Illumina測序并質控。使用R軟件（版本：v3.1.1）對原始數據進行均一化處理，按照相對表達量比值在1.5倍以上和P＜0.05作為差異表達標準。

1.3 差異circRNA來源基因功能注解及GO分析

由于目前沒有對circRNA進行注釋的信息，而對基因的注釋信息比較完整，因此我們對circRNA的來源基因做注釋。通過統計差異表達circRNA， 并利用 NCBI、Uniprot、GO 和 KEGG 等數據庫對差異表達circRNA的來源基因進行注釋，獲得來源基因詳細描述信息。GO是基因功能國際標準分類體系，提供了一套動態更新的標準詞匯表來全面描述生物體中基因和基因產物的屬性，通過對差異表達circRNA集合進行GO功能顯著性富集分析，來確定差異表達circRNA集合行使的主要生物學功能。

1.4 circRNA與miRNA相關調控靶基因預測

采用 miRanda（3.3a）軟件[8]的預測結果和靶位點信息。鑒于已知的報道和序列的可提取性，只選取數據庫中已存在的circRNA進行miRNA靶向關系預測。

2 結果

圖1 差異circRNA聚類圖

2.1 circRNA的差異表達分析

通過比較癌組織及癌旁組織circRNA的表達差異，利用R軟件對差異表達的circRNA進行層次聚類分析，得到差異circRNA聚類圖（圖1）。選取相對表達量比值在1.5倍以上和P＜0.05作為差異表達circRNA，得到上下調circRNA個數。芯片結果提示，與癌旁正常組織相比，NMIBC患者中表達量比值在1.5倍以上變化的有315條，其中上調的有158條，下調的有157條。篩選差異表達量上調和下調的前10位circRNA并對circRNA的上游來源基因做注解（表1）。其中，上調倍數最大的circRNA是hsa_circ_0010735，上升表達倍數為5.366倍；下調倍數最大的circRNA是hsa_circ_0008997，下調表達倍數為4.850倍。

表1 差異表達的circRNA

圖2 差異circRNA集合的GO統計柱狀圖

表2 差異表達circRNA預測靶向miRNA及其功能信息

2.2 差異表達circRNA的功能分析

GO數據庫中總共有3個部分，分別描述基因的分子功能 （Molecular Function）、細胞組分（Cellular Component）、 生物過程 （Biological Process）。對所篩選得到的已知circRNA進行GO分析并根據功能集合繪制柱狀圖，圖2結果提示，這些基因主要參與細胞生物學調控、細胞器功能、細胞粘附連接。其中在細胞組分部分中，下調的circRNA還可能參與到細胞膜功能調節。

2.3 circRNA與miRNA的靶向關系預測

使用miRanda（3.3a）軟件，對差異表達量上調和下調的前10位circRNA進行逐條預測，如表2示，發現hsa_circ_0004045與hsa_miR_7161_3p等4條circRNA分別有1個預測結合位點數。將上述circRNA在circBase、circNet等數據庫中進行查詢，獲得其功能等信息（如表2）。

3 討論

隨著我國逐漸進入老齡化社會，社會年齡結構發生變化，膀胱癌的發病率也呈逐年上升的趨勢。NMIBC作為膀胱癌最常見的發病類型，占約70%，經尿道膀胱腫瘤電切術是治療NMIBC的金標準[9]，通過經尿道的微創方法并輔以局部卡介苗或化療藥物灌注治療，大部分患者可獲得較好的預后。膀胱癌中約15%～25%為肌層浸潤性膀胱癌，大部分患者需要行根治性膀胱切除術輔以尿路改道或膀胱替代，創傷大、恢復時間長、預后相對較差。研究NMIBC的發病機制，尋找NMIBC的標志物，以便發現新的治療方法和及早識別NMIBC，顯得十分必要。

本研究通過Illumina測序技術篩選了NMIBC患者癌組織及癌旁正常組織中差異表達的circRNA，通過NCBI等數據庫對circRNA的來源基因進行系統搜索。本研究不僅篩選出多個已驗證的基因，如hsa_circ_0010735、hsa_circ_0007339、hsa_circ_0008275 等[11]，也篩選出hsa_circ_0004045這種未經驗證的circRNA。對所篩選得到的已知circRNA集合進行GO分析，發現差異表達的circRNA集合主要參與細胞生物學調控、細胞器功能、細胞粘附連接。在細胞組分部分中，下調的cicrRNA還可能參與到細胞膜功能調節。上述研究結果都為進一步的研究提供了方向。

circRNA作為一種競爭性內源RNA，具有miRNA海綿吸附作用，可通過影響相應miRNA的表達，進而參與靶基因的調控[12]。目前針對circRNA海綿吸附作用對膀胱癌的發生發展機制，已見部分研究報道。Zhong等[13]研究發現，circRNA MYLK可通過海綿吸附作用降低miR-558的活性，通過調節VEGFA/VEGFR2信號通路促進膀胱癌進展。Yang等[14]研究發現，circRNAITCH通過吸附miR-17/miR-224來調節p21和PTEN表達進而抑制膀胱癌進展。除了海綿吸附作用，circRNA還可通過調控基因轉錄，編碼多肽等其他方式發揮作用[15]。Li等[16]研究發現，circRNA BCRC4在膀胱癌中起抑制作用，并且至少部分通過上調miR-101的表達來介導抗癌功能。但以上均是針對個別circRNA的機制研究，膀胱癌差異表達的circRNA數目巨大，鑒于circRNA結構的特殊性，相對lncRNA而言，目前構建合適的circRNA表達載體仍有一定難度，完整的膀胱癌circRNA發病機制研究仍有待各國科研工作者共同解決。

本研究在NMIBC患者中circRNA差異表達譜中發現及預測到：hsa_circ_0004045與hsa_miR_7161_3p、hsa_circ_0006328 與hsa_miR_1285_3p、hsa_circ_0000837 與hsa_miR_939_5p、hsa_circ_0002229 與hsa_miR_1183可能存在分子海綿吸附作用，將上述 4個 circRNA在 circBase、circNet等數據庫中進行基因信息查詢，發現上述circRNA分別參與ATP的合成、鈣離子調控或細胞膜功能的調控、BCRA1基因的轉錄調控和脂質代謝等生物過程。通過相關數據庫及文獻檢索，尚未發現相關NMIBC的研究報道，可作為后續研究的突破點。接下來可通過大樣本qPCR驗證，進一步驗證各circRNA的表達情況，并構建相應circRNA的抑制和過表達載體，構建體外表達穩定株，尋找在體外細胞培養下相應細胞表型的變化及其相應的信號通路，使用RT-qPCR、熒光素酶報告基因實驗、免疫印跡技術等方式進一步驗證各circRNA與相應的miRNA海綿吸附關系，為探尋潛在的生物標志物或分子靶標提供新的思路。