血漿同型半胱氨酸水平及MTHFR基因C677T多態(tài)性與腦微出血的相關(guān)性研究

劉 蕾 ，馬 亮 ，朱先進(jìn) ，唐文雄 ，劉 倩 ，孫麗麗 ，劉尊敬 ?

（1.中日友好醫(yī)院 神經(jīng)科；2.檢驗科；3.放射科，北京 100029）

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是蛋氨酸循環(huán)的重要中間產(chǎn)物，Hcy代謝中的酶或輔酶改變會引起Hcy水平異常，亞甲基四氫葉酸還原酶（methleneterahudrofolate reductase，MTHFR）是影響Hcy代謝的一個關(guān)鍵酶，MTHFR基因C677T突變可導(dǎo)致血漿Hcy升高。

腦微出血（cerebral microbleed，CMB）是腦小血管病變引起的一種亞臨床腦實質(zhì)損害，以微小出血為主要特征，臨床上無典型癥狀和體征，其影像上的定義為磁敏感加權(quán)成像（susceptibility weighted imaging，SWI）或T2梯度回波序列上出現(xiàn)的直徑為2～5 mm的微小的圓形低信號病灶。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，HHcy及MTHFR基因多態(tài)性與腦小血管病密切相關(guān)，是腦白質(zhì)病變（white matter lesion，WML）的獨立危險因素。 CMB和WML同屬腦小血管病，既往研究表明，CMB與WML嚴(yán)重程度密切相關(guān)，目前HHcy及MTHFR基因多態(tài)性與CMB的相關(guān)性研究較少，結(jié)果尚存在爭論。本研究通過回顧性分析患者M(jìn)THFR基因多態(tài)性、HCY水平和影像學(xué)資料，探討MTHFR基因多態(tài)性、HCY水平與CMB的相關(guān)性及其臨床意義。

1 資料和方法

1.1 研究對象

2014年10月～2015年7月在中日友好醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡＞18歲；（2）同意進(jìn)行MTHFR基因檢測；（3）完成常規(guī)MRI和SWI檢查患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）伴有嚴(yán)重心、肺功能不全、嚴(yán)重肝、腎疾病或惡性腫瘤；（2）合并有其他影響血漿Hcy水平的疾病，如惡性貧血和甲狀腺功能低下；（3）服用影響血漿Hcy水平的藥物，如B族維生素、利尿藥、抗癲癇藥、左旋多巴等；（4）不能完成MRI檢查，如支架或起搏器植入；（5）多發(fā)性硬化、視神經(jīng)脊髓炎等中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病；中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、腦外傷、腦腫瘤、腦血管畸形等顱內(nèi)病變；阿爾茨海默癡呆、帕金森病等變性病；（6）心房顫動或感染性心內(nèi)膜炎等有心源性栓塞可能患者；（7）腦出血。

收集所有入組患者的基本資料，包括年齡、性別、吸煙、飲酒、高血壓、糖尿病及高脂血癥病史。急性缺血性卒中診斷需符合2010年中國急性缺血性卒中診治指南標(biāo)準(zhǔn)[1]，經(jīng)頭MRI證實。高血壓、糖尿病和高脂血癥的診斷均采用WHO標(biāo)準(zhǔn)。按照是否存在CMB分為CMB組和非CMB組。

1.2 研究方法

1.2.1 血漿Hcy水平及測定

于入院次日清晨空腹抽取靜脈血2ml，置EDTA抗凝管中，采集后立即充分混勻。采用美國DPC公司IMMUNLITE全自動化學(xué)發(fā)光分析儀及配套同型半胱氨酸測定試劑盒（循環(huán)酶法）對Hcy進(jìn)行檢測（正常值 5～15mmol/L）。

1.2.2 MTHFR基因多態(tài)性測定

患者知情同意后抽取外周靜脈血5ml，具體操作如下：（1）DNA提取：采用QIAGEN提取試劑盒，按照試劑說明書提取DNA，每份樣本提取后均采用Nanodrop1000微量分光光度計測定濃度和純度。（2）引物設(shè)計：引物設(shè)計參照文獻(xiàn)：MTHFR-F：GAGGCTGACCTGAAGCACTTGA， 標(biāo)記 Biotin；MTHFR-R：ATGCCTTCACAAAGCGGAAGA； 測序引物：5’-CGTGATGATGAAATCG-3’；由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。（3）PCR擴增：反應(yīng)體系50μl：上游引物1μl，下游引物1μl，2×master mix25μl，DNA 模 板 2μl， 水 21μl。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，60℃退火 30s，72℃延伸 30s，共 35 個循環(huán)；72℃延伸 10min。 （4）焦磷酸測序：取 25μl PCR 產(chǎn)物，分別加入結(jié)合緩沖液和親和素磁珠，振蕩15min，結(jié)合帶有生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物。真空泵吸附結(jié)合液后分別用70%乙醇、變性液和清洗液處理。PCR產(chǎn)物洗脫后加入測序引物。反應(yīng)液80℃變性2min后上焦磷酸測序儀運行，分析檢測結(jié)果。

1.2.3 其他生化指標(biāo)測定

于入院后次日清晨空腹抽取靜脈血檢驗血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、血糖（Glu）、尿酸（UA）、肌酐（Cr），采用全自動生化分析儀測定。

1.2.4 MRI

采用GE公司的3.0T磁共振成像系統(tǒng)進(jìn)行常規(guī) MRI和 SWI檢查。常規(guī) MRI包括 T1、T2、FLAIR以及DWI成像序列。

CMB診斷標(biāo)準(zhǔn)：SWI成像序列上表現(xiàn)為直徑2～5mm的圓形點狀低信號，邊界清楚，周圍無水腫，并排除鈣化、海綿狀血管瘤和橫斷面上大腦各動脈遠(yuǎn)端分支的小血管流空影。

所有MRI的判讀由對病史不詳?shù)?名影像科醫(yī)生和2名神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)生獨立閱片，診斷結(jié)果不一致時，采取多數(shù)人的意見。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 15.0軟件。計量資料組間比較的單因素分析采用獨立樣本的t檢驗；計數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗。采用Spearman等級相關(guān)分析確定血漿Hcy水平和MTHFR基因C677T多態(tài)性與CMB之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

本研究納入131例患者，其中男76例，平均年齡 66±10 歲（29～87 歲），急性缺血性卒中或短暫性腦缺血發(fā)作患者79例；CMB組66例，非CMB組65例，CMB組與非CMB組的人口統(tǒng)計學(xué)和臨床資料見表1。2組各指標(biāo)比較，均無顯著性差異（均 P＞0.05），具有可比性。

表1 CMB組與非CMB組的人口統(tǒng)計學(xué)和臨床資料比較

表2 2組MTHFR C667T基因型及等位基因分布比較

2.2 血漿Hcy水平與CMB的關(guān)系

CMB組平均血漿Hcy水平為14.91±6.68μmol/L，非 CMB組平均血漿 Hcy水平為17.46±13.51μmol/L，組間 Hcy水平無顯著性差異（P=0.383）。Spearman相關(guān)分析顯示，血漿Hcy水平與 CMB 無顯著相關(guān)性（rs=-0.114，P=0.196）。

2.3 MTHFR基因多態(tài)性與CMB的關(guān)系

表2示，2組間不但MTHFR C667T位點CC、CT及TT基因型分布無顯著性差異，C和T等位基因的分布也無顯著性差異。Spearman相關(guān)分析顯示，MTHFR C667T 基因型（rs=0.030，P=0.74）及等位基因分布（rs=0.022，P=0.73）與CMB無顯著相關(guān)。

3 討論

血漿Hcy受性別、年齡、葉酸水平、生活方式等遺傳多種因素影響，其中MTHFR C667T基因多態(tài)性是最重要的遺傳因素[2]。胞嘧啶堿基（C）突變?yōu)樾叵汆奏ぃ═），該基因編碼的氨基酸由纈氨酸取代丙氨酸，使MRHFR穩(wěn)定性和活性下降，Hcy甲基化為蛋氨酸過程受阻，Hcy蓄積，引起血漿Hcy水平升高。Hcy水平升高已被廣泛證實是心腦血管疾病的獨立危險因素[3]，而且和認(rèn)知功能下降相關(guān)[4]。近年來對卒中亞組分析研究結(jié)果顯示，與大血管性卒中相比，Hcy水平升高與腔隙性腦梗死和腦白質(zhì)病變等腦小血管病的關(guān)系更為密切[5，6]。而MRHFR基因多態(tài)性也被證實和腔隙性腦梗死和WML密切相關(guān)，T基因突變可增加WML 的體積[7]。

除了腔隙性腦梗死和WML外，腦小血管病還包括CMB，但是既往Hcy等相關(guān)研究較少涉及CMB。CMB反映了小血管的出血傾向，其組織病理基礎(chǔ)為沉積在小血管周圍的含鐵血黃素[8]，多為小動脈玻璃樣變性或者淀粉樣物質(zhì)沉積，導(dǎo)致小血管破裂，紅細(xì)胞溶解破壞產(chǎn)生的含鐵血黃素被巨噬細(xì)胞吞噬而沉積在血管周圍，常規(guī)MRI技術(shù)難以發(fā)現(xiàn)，需要通過SWI或T2梯度回波序列檢測。CMB與腦出血的關(guān)系密切，而且是影響腦卒中出血轉(zhuǎn)化、預(yù)后及復(fù)發(fā)，造成認(rèn)知功能下降的重要危險因素[9]。目前CMB已明確的危險因素主要有年齡增長、高血壓以及APOE基因多態(tài)性、NOTCH-3基因突變。HCY與CMB的關(guān)系尚有爭議，一些研究顯示，急性卒中患者HHcy與CMB無明顯相關(guān)[10，11]，也有研究發(fā)現(xiàn)，缺血性卒中或TIA患者HHcy與CMB顯著相關(guān)[11]。我們的研究結(jié)果支持HHcy與CMB無關(guān)，并且無論在急性或非急性缺血性卒中人群中，結(jié)論一致。此外，目前尚無MTHFR基因多態(tài)性與CMB關(guān)系的研究，我們對此進(jìn)行了統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)MTHFR基因多態(tài)性與CMB也無關(guān)。本研究結(jié)果提示HHcy及MTHFR基因多態(tài)性并非CMB的危險因素。

CMB和WML均屬腦小血管病，兩者密切相關(guān)，Yamada等研究[12]發(fā)現(xiàn)CMB的數(shù)目和WML改變程度呈正相關(guān)，但是與CMB的小動脈玻璃樣變性或者淀粉樣物質(zhì)沉積導(dǎo)致的出血不同，WML主要和缺血相關(guān)，其病理改變?yōu)樯窠?jīng)元脫失、缺血性脫髓鞘和膠質(zhì)細(xì)胞增生，主要發(fā)病機制是內(nèi)皮細(xì)胞損傷導(dǎo)致小動脈狹窄或閉塞和血腦屏障破壞后炎性細(xì)胞因子和膠質(zhì)細(xì)胞活化導(dǎo)致炎癥反應(yīng)[13]；而Hcy水平升高引起的病理改變主要是腦小血管的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷或激活炎癥反應(yīng)，與缺血更為相關(guān)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)血漿Hcy水平與CMB無關(guān)，支持兩者在病理和發(fā)病機制中存在的差異。因此，不同的腦小血管病，發(fā)病機制不盡一致，其危險因素也存在差異，臨床進(jìn)行腦小血管病評價時，應(yīng)全面評估，方能制定防治方案。

本研究尚存在一些不足，如樣本量偏小，未對血漿Hcy水平及MTHFR基因多態(tài)性與WML的關(guān)系，以及在急性缺血性卒中人群中和腔隙性腦梗死亞型的相關(guān)性進(jìn)行分析，今后應(yīng)進(jìn)一步擴大樣本量，來探討血漿Hcy水平及MTHFR基因多態(tài)性與WML和不同卒中亞型的相關(guān)性。

綜上所述，HHcy和MTHFR C677T基因多態(tài)性與腦微出血無關(guān)。不同類型的腦小血管病的危險因素、病理機制存在差異，對于腦小血管病患者需要全面綜合評估，從而制定防治方案。