人循環T細胞免疫指數模型評估結直腸癌患者手術預后的價值

秦靚 傅超 俞艷艷 丁菁 武文靜 姚江穎 何俊 張建鋒 張亮亮

結直腸癌是消化道常見的高度惡性腫瘤，近年來發病率呈上升趨勢[1]。盡管惡性腫瘤手術、放化療等治療取得了較大進展，但針對結直腸癌手術預后（生存及遠處轉移）的結果欠佳[1]。因此，尋找適宜的結直腸癌患者手術預后指標或標志物，以盡早發現預后不良的高?；颊呤悄壳把芯繜狳c及難點[2]。研究表明，浸潤性細胞免疫反應的改變與機體腫瘤的發生、發展及預后的關系密切[3]。相關文獻報道許多外周循環血細胞指標（如淋巴細胞、中性粒細胞、單核細胞等）可預測惡性腫瘤患者的預后，但對結直腸癌的預測報道很少[4]。本研究以CD4+調節性T細胞、CD8+調節性T細胞、CD28+細胞毒性T細胞為研究基礎，建立循環淋巴細胞免疫指數（circulating T-cell immune index，CTII）模型，探討其與結直腸癌患者臨床特征的關系以及評估手術預后的價值。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2010年1月至2013年1月行手術切除且經病理證實為結直腸癌的138例患者（杭州市第三人民醫院124例，成都中醫藥大學附屬醫院14例）為研究對象，其中男 83例，女 55例；年齡 30～72（44.37±12.7）歲。入選標準：（1）所有患者接受相應的標準化結直腸癌治療策略；（2）采集血標本前均未接受過其他任何抗腫瘤、輸血、放化療等治療。排除標準：（1）合并感染性疾病導致淋巴細胞異常者；（2）患有血液系統、骨髓系統、淋巴系統的疾病；（3）合并其他腫瘤患者。本研究經醫院倫理委員會審核通過，患者或其家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 CTII模型的建立 收集所有患者術前的循環CD4+調節性 T細胞、CD8+調節性 T細胞、CD28+細胞毒性T細胞的檢查資料，并計算CTII，CTII=CD28+細胞毒性T細胞/（CD4+調節性T細胞×CD8+調節性T細胞）?；颊叩哪挲g、性別、腫瘤TNM分期、腫瘤直徑、腫瘤位置、分化程度、淋巴細胞計數、中性粒細胞計數等資料均依據病程記錄和檢查報告進行歸納。

1.2.2 隨訪計劃的制定 通過患者復診、電話、信件等方式進行隨訪，術后2年內每3個月隨訪1次，2年后每6個月隨訪1次。術后隨訪5年，截止至2018年1月，失訪10例（包括非腫瘤相關死亡患者）。研究的主要終點事件為無病生存期（RFS）和總生存期（OS）。RFS：手術之日至第1次出現局部或區域復發轉移、隨訪終止或死亡的時間。OS：手術之日至出現任何原因引起的死亡或隨訪終止的時間。

1.3 統計學處理 應用SPSS 17.0統計軟件。根據ROC曲線計算CTII預測結直腸癌患者5年生存期的最佳截點值；采用χ2檢驗或Fisher精確概率法分析CTII與結直腸癌患者臨床特征的關系。采用Kaplan-Meier曲線、log-rank檢驗進行生存分析，并運用Cox比例風險回歸模型分析影響結直腸癌患者RFS和OS的因素。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CTII臨界值的確定及分組 CTII模型預測本研究結直腸癌患者5年RFS和OS的AUC分別為0.702和0.679，見圖1。根據AUC面積的比較以及相應約登指數的計算，確定以RFS為研究基礎，獲得CTII最佳截點值為0.08。根據最佳截點值將結直腸癌患者分為高CTII組（≥0.08）76例和低CTII組（＜0.08）62例。

圖1 CTII模型預測結直腸癌患者5年RFS和OS的ROC曲線（a：RFS分析；b：OS分析）

2.2 CTII與結直腸癌患者臨床特征的關系 不同CTII組患者的TNM分期、分化程度以及循環CD4+調節性T細胞、CD8+調節性T細胞、CD28+細胞毒性T細胞比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；而年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤位置、中性粒細胞計數、淋巴細胞計數比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表1。

表1 CTII與結直腸癌患者臨床特征的關系

2.3 CTII與結直腸癌患者的預后生存分析 高CTII組患者RFS、OS均明顯低于低CTII組（均P＜0.01），見圖2。

2.4 影響結直腸癌患者RFS和OS的Cox比例風險回歸模型分析 單因素分析結果顯示，TNM分期、分化程度、CTII指數與結直腸癌患者術后RFS和OS密切相關（均P＜0.05）；而腫瘤直徑、循環CD28+細胞毒性T細胞僅與RFS有關（均P＜0.05），CD8+調節性T細胞僅與OS有關（P＜0.05）。將上述P＜0.05的因素納入多因素分析，結果顯示TNM分期、分化程度、CTII是影響結直腸癌患者術后RFS和OS的獨立危險因素（均P＜0.05），見表2。

圖2 CTII與結直腸癌患者預后的生存曲線（a：RFS分析；b：OS分析）

3 討論

近年來研究證實，炎癥免疫細胞浸潤會改變腫瘤微環境，參與或抑制惡性腫瘤細胞的增殖和遷移[5]。相關研究表明，免疫細胞指數模型可作用于腫瘤免疫機制，從而發揮作用[6]。因此，免疫細胞指數模型可能成為惡性腫瘤的新生物標志以及判斷預后的細胞靶點。CTII模型是以CD4+調節性T細胞、CD8+調節性T細胞、CD28+細胞毒性T細胞為研究基礎，通過拮抗-促進的相互作用來調控腫瘤發生、發展，從而實現復雜的免疫防御功能，在臨床上具有準確的預測價值和廣闊的應用前景。

結直腸癌是消化系統常見的惡性腫瘤，其致死率較高[1]。因此，亟需尋找一種新的腫瘤標志物來判斷預后，以提高結直腸癌的個體化治療效果。Hagland等[7]報道在循環淋巴細胞于Ⅰ～Ⅲ期結直腸癌患者分布中，CD4+及CD8+T細胞參與惡性腫瘤侵襲，進而影響預后。進一步研究表明，CTII與多種惡性腫瘤遠期預后密切相關，如肺癌、肝癌、胰腺癌[8-10]。目前關于CTII對結直腸癌的預測價值尚不清楚。因此，本研究從結直腸癌患者外周血細胞入手，利用ROC曲線評價結直腸癌患者預后，發現CTII模型在RFS所對應的AUC大于OS所對應的AUC，但差異無統計學意義；在一定程度上提示RFS的最佳截點在評價結直腸癌患者預后的準確性方面具有優勢。進一步分析CTII與臨床特征及預后生存的關系，結果表明CTII與TNM分期、分化程度有關，推測CTII變化可能打破腫瘤微環境免疫平衡，從而參與腫瘤的發生、發展。亦有研究表明TNM分期、分化程度是影響結直腸癌治療及預后的指標[11]。此外，本研究發現CTII與結直腸癌患者術后的RFS和OS密切相關，高CTII提示預后較差。同時進一步作Cox比例風險回歸模型分析，證實TNM分期、分化程度、CTII是影響結直腸癌患者預后不良的獨立危險因素。可見，CTII可作為評價結直腸癌術后復發風險和OS的預測指標。

表2 影響結直腸癌患者RFS和OS的Cox比例風險回歸模型分析

目前關于上述規律的發生機制尚未證實，主要認為惡性腫瘤的發生起點在于感染或炎癥反應，此類感染或炎癥可引起CTII升高。本實驗結果為CD28+細胞毒性T細胞增多，或CD4+調節性T細胞、CD8+調節性T細胞減少。CD28+細胞毒性T細胞是調節細胞凋亡的重要炎性細胞，與腫瘤-免疫平衡的發生、發展存在相互效應。一方面，腫瘤細胞可釋放粒細胞集落刺激因子、IL-2、TNF等細胞因子，從而促進CD28+細胞毒性T細胞大量增殖[12]；另一方面，CD28+細胞毒性 T細胞通過 PD-1、GSK-3等途徑與腫瘤細胞對抗[13]。這意味著CD28+細胞毒性T細胞可間接反映腫瘤惡性程度。此外，有研究表明，CD4+/CD8+淋巴細胞介導的細胞毒性反應以及釋放的細胞因子，均能抑制腫瘤的增殖與轉移行為[14]。隨著腫瘤的生長，機體炎癥與抗腫瘤之間失去平衡，體內循環淋巴細胞比例發生變化。因此，外周血CTII高則反映患者全身炎性反應較嚴重，抗腫瘤免疫功能較差，提示預后不良。

綜上所述，CTII模型對結直腸癌患者預后的評估具有指導價值，是一項易檢測、重復性好、價格低廉的腫瘤相關性炎癥指標；其中高CTII提示預后不良。聯合中性粒細胞/淋巴細胞、血小板/淋巴細胞等因素建立模型，對結直腸癌遠處轉移的診斷具有參考價值[15-16]；建議進一步聯合多指標進行研究，以提高預測的準確性。