FTY720對蛛網膜下腔出血大鼠海馬神經元凋亡的抑制作用

張杰 董曉巧 俞文華 杜權 王昊 楊定博 沈永鋒 江力 朱強 車志豪

免疫反應是造成蛛網膜下腔出血性腦損傷的重要原因之一[1-2]。FTY720是一種來源于冬蟲夏草且具有雙向調節作用的新型免疫抑制劑，在體內抑制免疫反應發生的同時不破壞機體對病毒的免疫應答及免疫記憶能力，不良反應小，生物利用度高[3]。FTY720可用于器官移植、自體免疫疾病、腫瘤、炎癥等疾病的治療；目前，在腎移植排斥反應中的應用進入Ⅲ期臨床試驗，在多發性硬化癥中的應用進入Ⅱ期臨床試驗[4-7]。本研究采用FTY720腹腔注射治療大鼠蛛網膜下腔出血，觀察其對大鼠海馬神經元凋亡的抑制作用，從而揭示其腦保護作用。

1 材料和方法

1.1 材料 健康Wistar大鼠（雄性，清潔級,南京大學模式動物研究所提供）；FTY720（批號：SML0700，規格：25mg，美國Sigma公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（批號：23229，美國Thermo Scientific公司）；原位末端標記（TUNEL）試劑盒（批號：MK1024，中國武漢博士德生物工程有限公司）；Caspase-3和Caspase-9底物（批號：T9281、T9275，美國 Livemore公司）；轉印槽（型號：Trans-Blot，美國 Bio-Rad公司）；電泳儀（型號：EPS-200，上海天能科技有限公司）；小型垂直電泳槽（型號：164-8001，美國 Bio-Rad公司）；脫色搖床（型號：TY-80B，常州澳華儀器有限公司）；生物倒置顯微鏡（型號：IX-71，中國奧林巴斯有限公司）；低溫高速離心機（型號：BECKMAN，北京普瑞麥迪實驗室技術有限公司）；熒光分光光度計（型號：UV-1202，日本島津公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將48只大鼠隨機分成正常組、假手術組、模型組和治療組，每組12只。4組大鼠均予50mg/kg戊巴比妥鈉腹腔麻醉，采用枕大池二次注血法制作蛛網膜下腔出血大鼠模型，假手術組大鼠兩次注入等量0.9%氯化鈉注射液。治療組大鼠模型形成前0.5h按1mg/kg腹腔注射FTY720，另外3組大鼠腹腔注射0.9%氯化鈉注射液1ml。24h后，大鼠以80mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射深度麻醉，斷頭處死，分離海馬組織。正常組大鼠24h內均未死亡，假手術組大鼠24h內死亡1只，模型組大鼠24h內死亡3只，治療組大鼠24h內死亡2只；4組大鼠死亡率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。大鼠死亡后補充成活大鼠，保證每組12只。

1.2.2 細胞凋亡檢測 取部分海馬組織，固定、脫水，常規石蠟包埋，切取厚約4μm的超薄切片，行TUNEL檢測：（1）組織切片 60℃烤 2h；（2）二甲苯洗 5min×2 次；（3）分別使用無水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇和70%乙醇洗 1 次，3min/次；（4）PBS 洗滌 5min×3 次，3%H2O2甲醇溶液處理 10min；（5）PBS 洗滌 5min×3 次，加入細胞通透液孵育 8min；（6）PBS 洗滌 5min×3 次，加入50μl TUNEL反應混合液，濕盒和暗室中37℃孵育1h；（7）PBS洗滌 5min×3次，加入 50μl轉化-POD，濕盒中37℃孵育 30min；（8）PBS 洗滌 5min×3 次，二氨基聯苯胺法顯色，蘇木精復染 2～5min；（9）PBS 洗滌 5min×3 次；（10）分別使用70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇和無水乙醇洗 1 次，3min/次；（11）二甲苯洗 5min×2 次；（12）封片、干燥后，在光學顯微鏡下觀察并記錄實驗結果。細胞核染色呈棕黃色或棕紅色定義為細胞染色陽性；在光學顯微鏡下計算10個高倍鏡視野，每個視野計數100個細胞，總計1 000個細胞，計算平均陽性率（%）。

1.2.3 蛋白表達的檢測 Western blot法檢測大鼠海馬組織原癌基因（c-fos）、pro-Caspase-3和 pro-Caspase-9蛋白表達。取部分組織按1∶10（密度：體積）加入細胞裂解液，冰上勻漿，13 000g離心20min，收集上清液；BCA法測定蛋白濃度，等量蛋白（50μg）經12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉移至聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉（TBST）室溫封閉1h；加入相應兔抗大鼠c-fos、pro-Caspase-3和 pro-Caspase-9單克隆抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜，TBST 洗膜 3次；加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗（1∶10 000）室溫搖床孵育1h，TBST洗膜3次；ECL試劑作用5min，X線膠片曝光。沖洗并掃描后，結果用Quality One軟件分析雜交條帶灰度值，以磷酸甘油醛脫氫酶水平為內參對照計算相對灰度值，即c-fos、pro-Caspase-3和pro-Caspase-9蛋白表達水平。

1.2.4 蛋白活性的檢測 四肽熒光底物法檢測Caspase-3和Caspase-9蛋白活性。取腦組織勻漿100μl和Caspase-3 底物（AC-DEVD-AMC）10μl，加入 4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）緩沖液至 1ml，37℃孵育 1h；用熒光分光光度計在激發波長380nm、釋放波長460nm處測定熒光強度。取腦組織勻漿100μl和Caspase-9底物（AC-LEHD-AFC）10μl，加入 HEPES 緩沖液至 1ml，37℃孵育1h；用熒光分光光度計在激發波長400nm、釋放波長505nm處測定熒光強度。以未加腦組織時的熒光強度為參照計算相對熒光強度，即Caspase-3和Caspase-9蛋白活性。

1.3 統計學處理 應用SPSS 19.0統計軟件，計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FTY720對海馬神經元凋亡的影響 正常組和假手術組大鼠凋亡的海馬神經元比例分別為（7.5±0.40）%、（7.7±0.41）%，組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）；模型組大鼠凋亡的海馬神經元比例為（27.1±0.90）%，較正常組、假手術組均明顯升高（均P＜0.05）；治療組大鼠凋亡的海馬神經元比例為（15.5±0.51）%，較模型組明顯下降（P＜0.05），見圖 1。

2.2 FTY720對 c-fos、pro-Caspase-3和 pro-Caspase-9蛋白表達水平的影響 正常組與假手術組大鼠海馬組織c-fos、pro-Caspase-3和pro-Caspase-9蛋白表達水平比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）；模型組較正常組、假手術組均明顯增加（均P＜0.05）；治療組較模型組均明顯下降（均P＜0.05），見表1和圖2。

圖1 FTY720對蛛網膜下腔出血大鼠海馬神經元凋亡的影響（×20）

表1 4組大鼠c-fos、pro-Caspase-3和pro-Caspase-9蛋白表達水平比較（%）

圖2 4組大鼠c-fos、pro-Caspase-3和pro-Caspase-9蛋白表達的電泳圖

2.3 FTY720對Caspase-3、Caspase-9蛋白活性的影響 正常組與假手術組大鼠海馬組織Caspase-3、Caspase-9蛋白活性比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）；模型組較正常組、假手術組均明顯增加（均P＜0.05）；治療組較模型組均明顯下降（均P＜0.05），見表2。

表2 4組大鼠Caspase-3、Caspase-9蛋白活性比較（%）

3 討論

蛛網膜下腔出血是腦動脈瘤破裂的常見表現，出血導致的早期腦損傷會影響患者的預后[8-9]。免疫反應是繼發性腦損傷病理、生理機制的重要組成部分，也參與蛛網膜下腔出血繼發的早期腦損傷過程。腦組織局部免疫反應增強會加重腦組織的繼發性腦損傷[1-2]，為臨床應用免疫抑制劑治療蛛網膜下腔出血早期腦損傷提供一定的實驗依據。但臨床常規免疫抑制劑可導致全身免疫功能降低，繼發感染。因此，尋找一種安全、有效的免疫抑制劑對降低蛛網膜下腔出血早期腦損傷具有重要意義。FTY720是一種新型的免疫抑制劑，是將冬蟲夏草提取物中具有免疫抑制作用的成分ISP-I進行結構改造而成，屬于鞘氨醇-1-磷酸鹽受體阻滯劑[5]。FTY720在體外以無活性的形式存在，在體內經鞘氨醇激酶2磷酸化為具有生物活性的（S）-FTY720-P異構體而發揮作用。FTY720主要用于抑制器官移植所引起的排斥反應，還可用于治療皮炎、重癥肌無力等免疫紊亂/障礙疾病及某些轉移性癌癥[3-7]。神經細胞凋亡是較為復雜的病理、生理過程，涉及諸多信號通路和信號蛋白。c-fos蛋白是神經細胞中常見的快速反應蛋白，參與細胞的生長、發育、分化、記憶和信息傳遞等過程。在出血、缺血、缺氧和創傷等刺激下，c-fos基因早期表達增加，與神經細胞凋亡相關[10-11]。pro-Caspase-3、pro-Caspase-9 是凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9的無活性前體形式，當受到凋亡信號刺激后，會酶解成Caspase-3、Caspase-9活性二聚體形式。其中Caspase-3蛋白為凋亡執行者，可直接降解胞內結構蛋白和功能蛋白，引起凋亡。而Caspase-9是凋亡啟動者，受到凋亡信號刺激后，Caspase-9自剪接激活，引起Caspase級聯反應[12-14]。本研究發現正常組、假手術組大鼠海馬神經元凋亡不明顯，c-fos、pro-Caspase-3和pro-Caspase-9蛋白表達亦不明顯，Caspase-3、Caspase-9活性不高；模型組大鼠神經元凋亡比例明顯增加，c-fos、pro-Caspase-3和pro-Caspase-9蛋白表達明顯升高，Caspase-3、Caspase-9活性亦明顯增高。這提示以上生化指標可在一定程度上反映神經元凋亡程度。

目前FTY720用于動物實驗中腦損傷治療的劑量均選用1mg/kg，一般在腦損傷動物模型形成前短時間內腹腔或靜脈注射[15-17]。既往動物實驗證實，神經元凋亡一般在腦損傷后24～72h達到高峰[12-14]，且有關FTY720用于腦損傷治療的研究也一般選擇在腦損傷后24h進行神經功能評估和腦組織取樣[15-17]?；谝陨弦蛩?，本研究在蛛網膜下腔出血模型形成前短時間（0.5h）內按1mg/kg腹腔注射FTY720治療腦損傷大鼠，且神經元凋亡檢測的時間選擇在外傷后24h。另外，本實驗期間有少量大鼠死亡，但4組大鼠死亡率比較差異無統計學意義，這保證了實驗的均衡性。本實驗結果發現，腹腔注射FTY720后，大鼠海馬組織神經元凋亡比例，c-fos、pro-Caspase-3和 pro-Caspase-9蛋白表達水平以及Caspase-3、Caspase-9蛋白活性均表現出不同程度的下降，提示FTY720可抑制蛛網膜下腔出血大鼠海馬神經元的凋亡。最近研究表明FTY720可抑制體外培養膠質細胞分泌炎性因子[18]，阻止腦外傷大鼠皮層炎性細胞聚集[19]，抑制動物腦出血后腦內淋巴細胞浸潤[15]。FTY720也能明顯抑制短暫性腦缺血大鼠神經元凋亡[16]，減輕腦出血大鼠腦水腫[17]。以上研究結果提示，FTY720對蛛網膜下腔出血大鼠神經元凋亡的抑制作用可能與其抑制中樞神經系統炎癥反應有關。已有研究發現，FTY720可用于治療大鼠腦缺血，且不會增加機體的細菌感染率[20]。這說明FTY720用于治療蛛網膜下腔出血早期腦損傷是安全、可靠的。然而，藥效與用藥時間和劑量密切相關，這方面有待進一步研究。