稀釋涂布平板法計數(shù)活菌的方法簡介

龔軍輝 王 晶

(河北省保定市第一中學(xué) 071000)

1 問題的提出

“微生物數(shù)量的測定”是2017年高考考綱中新增加的內(nèi)容，同時也是教學(xué)的重難點。稀釋涂布平板法是對微生物計數(shù)的常用方法，用來統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目。當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約有多少活菌。但對菌落計數(shù)的結(jié)果處理往往成為學(xué)生的易錯點。

經(jīng)典例題：在從土壤中分離產(chǎn)脲酶細(xì)菌的實驗中，將10g土壤樣液梯度稀釋，在3個培養(yǎng)基平板上均接種稀釋倍數(shù)為105的土壤樣液0.1mL，培養(yǎng)一段時間后，平板上長出的細(xì)菌菌落數(shù)分別為42、200、256。則1g土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)量為________個。

很多學(xué)生得出的答案為：1.66×108。同時，學(xué)生對于42這個數(shù)據(jù)如何處理存在疑問：是否需要舍棄？如果需要舍棄，標(biāo)準(zhǔn)是什么？

2 菌落計數(shù)的基本原則

2.1 教材中的相關(guān)表述 在人教版高中生物學(xué)選修1《生物技術(shù)實踐》中，對于稀釋涂布平板法計數(shù)菌落有如此的表述：為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計數(shù)。但是，若想當(dāng)然地認(rèn)為42、200、256三個數(shù)據(jù)均處于30～300范圍之內(nèi)，然后直接求平均值，再乘以稀釋倍數(shù)，就會得出1.66×108的錯誤結(jié)果。這也是很多學(xué)生產(chǎn)生錯誤的原因。

事實上，教材中的相關(guān)表述只是在說明可計數(shù)的菌落數(shù)量的適宜范圍。某一稀釋度下的3個平板中菌落數(shù)并不能簡單地直接求平均值，還應(yīng)該關(guān)注稀釋度的設(shè)置以及計數(shù)結(jié)果的允許差。

2.2 稀釋度的設(shè)置及計數(shù)原則 為了確保有效活菌數(shù)的準(zhǔn)確測定，在采用平板計數(shù)檢測中，必須設(shè)3個稀釋度且成梯度，每個梯度設(shè)3個重復(fù)[1]。測定土壤中細(xì)菌的數(shù)量，一般選用104、105和106倍的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)；測定放線菌的數(shù)量，一般選用103、104和105倍稀釋；測定真菌的數(shù)量，一般選用102、103和104倍稀釋。

如果平板中菌落的數(shù)量太少，必然會導(dǎo)致計數(shù)誤差太大；反之，如果平板中菌落數(shù)量過多，會造成計數(shù)上的困難。因此，國際上通用的菌落計數(shù)的基本原則，是以平板上出現(xiàn)30～300個菌落數(shù)的稀釋平板為計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。同時要求，同一個稀釋度重復(fù)3次的平板上菌落數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差值應(yīng)小于允許差值[2]。也就是說，在平板計數(shù)檢測中，如果同一稀釋度下的3次重復(fù)菌落數(shù)雖然均處于30～300個范圍之內(nèi)，但數(shù)據(jù)相差較大，就需要舍棄。

2.3 同一稀釋度下3個重復(fù)的允許差值 標(biāo)準(zhǔn)差的計算公式如下：

平板菌落數(shù)的允許差值如表1[3]。

表1 平板菌落數(shù)允許差值

由表1可知，如果平板上3次重復(fù)的菌落平均數(shù)較小，其允許的誤差就?。环粗?，如果菌落平均數(shù)較大，則其允許的誤差就大一些。若選一個適宜稀釋度計數(shù)，則3個重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差值應(yīng)小于規(guī)定的允許差值。若3個重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差值大于規(guī)定的允許差值，則無法正確計數(shù)，必須重新測定。

2.4 對例題的進(jìn)一步分析 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差公式，對上述例題計算如下：

參照表1中菌落數(shù)的允許差值可以看出，平板菌落平均數(shù)166處于101～300之內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)所允許差值為±≤50。但經(jīng)計算得知，該稀釋度下3個平板菌落數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差值±111已遠(yuǎn)超允許差值。因此，本次的計數(shù)結(jié)果不符合要求，無法正確計數(shù)，需要重做。

3 拓展

為更好地理解和熟練掌握微生物平板菌落計數(shù)的數(shù)據(jù)處理方法，提供3組示例(表2)以供參考和借鑒。

表2 平板菌落計數(shù)的數(shù)據(jù)處理示例