凍胚移植周期中培養液蛋白添加物濃度對臨床結局的影響

張嶺，舒靜，張琳，李施施，黃瓊曉，傅曉華，朱晶，徐維海

（浙江省人民醫院，浙江 杭州 310014）

優質的培養體系是保證體外受精-胚胎移植（IVF-ET）治療結局的一個重要因素。蛋白添加物是胚胎培養液中的重要成分，發揮著調節膠體滲透壓、防止胚胎粘連、中和毒素、提供營養成分等重要作用[1]。目前，商品化的蛋白添加物主要有人血清白蛋白（HSA和 Buminate）和復合蛋白添加物（SSS、SPS和LGPS）[2]。在凍胚移植周期中，胚胎在解凍后會被置于適當的囊胚培養液中，使其恢復細胞活性。不同實驗室在囊胚培養液中添加的蛋白濃度存在很大差異（2.5%~50%），但具體哪個濃度更有利于臨床結局，尚無明確結論。本文采用隨機對照試驗比較兩種不同濃度蛋白添加物對凍胚移植后臨床結局的影響，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 以2017年6-12月在本院行凍胚移植治療的患者為研究對象。納入標準：（1）年齡＜35 歲；（2）首次接受 IVF-ET 治療者；（3）移植胚胎為3日齡卵裂胚。排除標準：（1）存在宮腔因素（移植日子宮內膜<7mm、宮腔粘連、子宮畸形等）；（2）夫婦任何一方存在染色體異常者；（3）隨訪依從性差或主動要求退出研究者。患者基礎情況、治療處理措施等資料均從本院輔助生殖中心病例數據庫中提取。研究已通過本院生殖倫理學委會員審查，相關研究均獲得患者夫婦的知情同意。共納入60例研究對象，電腦隨機分成高蛋白添加物組（10%SSS，簡稱 “高蛋白組”）和低蛋白添加物組（5%SSS，簡稱“低蛋白組”），每組 30例。兩組在年齡、體質量指數（BMI）、抗繆勒氏管激素（AMH）、不孕類型、授精方式、移植日子宮內膜厚度、移植胚胎數、移植優質胚胎數上差異均無統計學意義 （均P＞0.05）。詳見表1。

1.2 方法 （1）實驗室處理：培養體系采用Vitro Life G系列培養液（G2培養液），于移植前1天配制培養液。高蛋白組為G2+10%SSS，低蛋白組為G2+5%SSS，培養液表面覆蓋礦物油，于培養箱中平衡16小時以上。移植當天采用玻璃化解凍方法解凍3日齡冷凍胚胎，復蘇后將胚胎置于平衡好的培養液中繼續培養2小時左右，按照本中心常規操作規范進行胚胎移植。（2）臨床處理：依據本中心臨床操作規范，凍胚移植常規采用兩種內膜準備方案，分別為激素替代周期（HRT）和自然周期（NC）。在HRT中，患者于月經第3天（排除非經期異常出血）口服補佳樂3mg（戊酸雌二醇片，拜耳醫藥）2次/d，1周。1周結束時，若血液雌二醇（E2）濃度達150pg/mL且子宮內膜厚度達7mm（雙層）以上，則繼續服用補佳樂5天，然后肌肉注射黃體酮40mg以轉化內膜，3天后行胚胎移植。如口服補佳樂1周后血E2或內膜厚度未達上述標準，則在原有基礎上再經陰道予半片白色芬嗎通片 （含雌二醇0.5mg，雅培制藥），5天后重新評估。在自然周期中，患者自月經第9天起接受卵泡監測，如排卵前內膜厚度＞7mm且血E2＞150pg/mL，于排卵當日肌肉注射黃體酮40mg，3天后行胚胎移植。

表1 兩組基礎資料比較

1.3 觀察指標 移植后第14天查血、尿人絨毛膜促性腺激素（hCG），若hCG陽性，則于移植后4周行超聲檢查，若超聲檢查見孕囊則判定為臨床妊娠，若未見孕囊則判定為生化妊娠。此后，隨訪至移植后8周并記錄妊娠狀態，包括流產（8周時胎體已丟失）、繼續妊娠（移植后8周時胎體仍健在）、異位妊娠（胎體位于子宮外器官中）和妊娠胎數。最后，計算胚胎著床率、臨床妊娠率、流產率、繼續妊娠率和多胎率 （妊娠胎數≥2個）。各計算公式如下：胚胎著床率=妊娠胎數／移植胚胎數×100%；臨床妊娠率=妊娠例數/移植例數×100%；流產率=流產例數/臨床妊娠例數×100%；多胎率=多胎例數/臨床妊娠例數×100%；繼續妊娠率=繼續妊娠例數/移植例數×100%。

1.4 統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件對相關數據進行統計學分析。計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料采用χ2檢驗或校正χ2檢驗。

2 結果

移植后隨訪數據顯示，兩組hCG陽性率、生化妊娠、臨床妊娠、流產、繼續妊娠、胚胎著床、多胎數和異位妊娠指標均無統計學差異（均P＞0.05），詳見表2。

表2 兩組胚胎移植妊娠結局[n（%）]

3 討論

冷凍胚胎移植是IVF-ET技術中常用的治療策略，既有利于降低卵巢過度刺激的風險，又避免了因一些近期不良因素（如宮腔、盆腔、免疫等因素）導致的移植失敗和胚胎浪費[3]。在凍胚移植周期，胚胎須經歷冷凍復蘇過程，伴隨細胞形態與結構的改變、細胞器的移位與復位、細胞脫水與復水等過程[4]。所以，冷凍復蘇后的胚胎往往對不良培養環境更加敏感，需要選擇適當的培養環境以保證胚胎正常的結構與活力的恢復[5]。

蛋白添加物是臨床胚胎實驗室中常用的培養液成分，但不同實驗室對蛋白添加物的種類和添加濃度的選擇上仍存在著較大差異，尤其是在囊胚培養和胚胎移植液中。文獻資料顯示，不同實驗室在移植前培養液中使用的蛋白濃度范圍從2.5%至50%不等，但考慮到安全性問題，絕大多數將濃度控制在10%以下[6]。但具體哪種蛋白濃度最優尚缺乏數據支持，僅有的研究也只是分析了不同蛋白濃度對新鮮胚胎移植結局的影響[6]，尚無對凍胚移植影響的報道。

本研究首次探討了兩種臨床上最常用的蛋白添加物濃度（5%和10%）對凍胚復蘇移植后臨床結局的影響。結果顯示，兩組hCG陽性率、生化妊娠、臨床妊娠、流產、繼續妊娠、胚胎著床、多胎數和異位妊娠指標差異均無統計學意義（均 P＞0．05），這與以往針對新鮮胚胎移植的報道相一致[6]，但這是否與研究病例較少（最終病例數僅60例）有關尚需更多的數據支持。考慮到高蛋白組的胚胎著床率較低蛋白組低10%，本研究及時終止了試驗。未來將采取觀察性研究，如多中心隊列或病例對照研究來分析不同蛋白濃度組之間凍胚移植結局的差異。