靶向抑制IGF-1R逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌對(duì)EGFR-TKIs獲得性耐藥的研究

張曦 ，黃選章 ，曾云云 ，張為民 *

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江 溫州 325000；2.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院，廣東 廣州510010）

肺癌已經(jīng)進(jìn)入分子靶向治療的時(shí)代，以吉非替尼、厄洛替尼為代表的表皮生長(zhǎng)因子酪氨酸激酶抑制劑 （epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）被廣泛應(yīng)用于晚期非小細(xì)胞肺癌的各線治療，然而耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)成為制約靶向治療進(jìn)一步應(yīng)用的瓶頸[1-2]。因此，發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌對(duì)EGFR-TKIs的獲得性耐藥機(jī)制、尋找逆轉(zhuǎn)耐藥的新途徑具有重要的臨床意義。既往研究發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長(zhǎng)因子I型受體（insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R）參與介導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌EGFR-TKIs的獲得性耐藥[3-4]，但抑制IGF-1R表達(dá)是否能逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs的獲得性耐藥未見報(bào)道。因此，本研究擬通過(guò)RNAi技術(shù)，觀察抑制IGF-1R表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞EGFR-TKIs的敏感性及IGF-1R下游相關(guān)信號(hào)通路的影響，以探討靶向抑制IGF-1R對(duì)逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌EGFR-TKIs獲得性耐藥的影響及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 非小細(xì)胞肺癌EGFR-TKIs耐藥細(xì)胞株H460/ER由課題組前期培養(yǎng)所得；三質(zhì)粒慢病毒載體系統(tǒng)購(gòu)自吉?jiǎng)P基因公司；DMSO、MTT購(gòu)自Sigma公司；1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；限制性內(nèi)切酶、T4DNA ligase M0202v、T4DNA ligase buffer購(gòu)自NEB公司；Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司；Trizol購(gòu)自 Invitrogen公司；QIAGEN Plasmid大抽Kit購(gòu)自QIAGEN公司；PCR引物由上海吉?jiǎng)P基因公司合成 （IGF-1R上游引物：5’-TGCGTGAGAGGATTGAGTTTC-3’，下游引物：5’-CTTATTGGCGTTGAGGTATGC-3’；內(nèi)參GAPDH上游引物：5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，下游引物：5’ -CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’；qRT-PCR試劑盒購(gòu)自羅氏公司；EGFR、IGF-1R、ERK、AKT、p-IGF-1R、p-EGFR、p-AKT、p-ERK、β-actin 等蛋白一抗和二抗均由Cell Signaling公司提供；24孔Transwell板購(gòu)自Corning公司。

1.2 siIGF-1R重組慢病毒載體的構(gòu)建及病毒包裝

1.2.1 慢病毒載體的構(gòu)建 按照GeneBank提供的IGF-1R基因編碼區(qū)，設(shè)計(jì)3對(duì)相應(yīng)shRNA序列，通過(guò)BLAST分析及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定干擾靶序列“GCTTCACCGTTTACTACAA”，委托上海吉?jiǎng)P公司合成干擾序列的雙鏈DNA oligo。將退火后的dsDNA與雙酶切后的穿梭載體連接轉(zhuǎn)化，挑選陽(yáng)性克隆行PCR鑒定與測(cè)序。

1.2.2 病毒的包裝及滴度測(cè)定 以lipofectamine 2000試劑介導(dǎo)的瞬時(shí)感染方法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)8小時(shí)后倒去含有感染混合物的培養(yǎng)基，以少量PBS洗滌殘余的感染混合物，加入含血清的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，收集并離心濃縮細(xì)胞上清液，分裝后-80℃保存。取其中一管測(cè)定：取出凍存細(xì)胞接種于96孔板中，24小時(shí)后每孔吸去90μL 培養(yǎng)基，分別為 10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6μL的病毒顆粒稀釋液中加入等量病毒原液，培養(yǎng)24小時(shí)后換成完全培養(yǎng)基，熒光顯微鏡下觀察帶綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量。病毒滴度=帶熒光的細(xì)胞數(shù)/病毒原液。

1.3 慢病毒轉(zhuǎn)染H460/ER細(xì)胞 用胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H460/ER細(xì)胞，將其制成懸液后接種于6孔板中，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)使細(xì)胞融合至約30%，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索的MOI值（20）加入適量病毒，48小時(shí)后用含5μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，感染72小時(shí)后在熒光顯微鏡下拍照，觀察感染率。

1.4 qRT-PCR法和Western Blot法檢測(cè)慢病毒對(duì)H460/ER細(xì)胞IGF-1R的抑制效應(yīng)

1.4.1 qRT-PCR法測(cè)定IGF-1R的mRNA水平 用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，行引物PCR擴(kuò)增。采用20μL反應(yīng)體系：滅菌水7μL，2xSYBR GreenMaster10μL，10μM上、下游各引物 0.6μL，DNA模板2μL。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5秒，95℃5秒，60℃30秒，一共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)（95℃，15秒→60℃，15秒→95℃，15秒）。重復(fù)測(cè)定3次。數(shù)據(jù)由PCR儀自帶軟件完成收集。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-△CT法分析。

1.4.2 Western Blot法檢測(cè)IGF-1R的蛋白表達(dá)水平取消化后的各組細(xì)胞用蛋白提取液提取其中的總蛋白質(zhì)。BCA法測(cè)定蛋白濃度，行10%SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5%牛血清白蛋白封閉約2小時(shí)，按說(shuō)明書及前期實(shí)驗(yàn)所得比例加入各蛋白一抗，于4℃搖床上反應(yīng)過(guò)夜，洗膜3次，再加入二抗，搖床反應(yīng)1小時(shí)，再次洗膜3次，得到的蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。以β-actin為內(nèi)參照，用Quantity One圖像軟件對(duì)條帶進(jìn)行光密度值分析。

1.5 MTT法檢測(cè) 靶向抑制IGF-1R后H460/ER細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs敏感性變化 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為 1×105個(gè)/mL，5%CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）。設(shè)9個(gè)濃度梯度，每組取4個(gè)平行復(fù)孔，邊緣孔用無(wú)菌PBS填充。細(xì)胞貼壁后，每孔加入100μL含不同濃度厄洛替尼的培養(yǎng)液，培養(yǎng)72小時(shí)再向孔內(nèi)加入20μL 0.5%的MTT，培養(yǎng)4小時(shí)棄掉上清液后再加入150μL二甲基亞砜，振蕩10分鐘后酶標(biāo)儀下測(cè)定各孔吸光度值（492nm波長(zhǎng)），計(jì)算細(xì)胞存活率及其半抑制率（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn) 檢測(cè)靶向抑制IGF-1R后H460/ER細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力的變化（1）劃痕實(shí)驗(yàn)：收集兩組細(xì)胞，按 5.0×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板上，融合至80%時(shí)用無(wú)血清培養(yǎng)液饑餓過(guò)夜，第2天用200μL無(wú)菌移液器槍頭在皿底部劃3條平行直線，用PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，放入5%CO237℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24小時(shí)后取樣，置于熒光顯微鏡（×40）下拍照。 （2）Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)：Transwell板上室每孔加入無(wú)血清培養(yǎng)液200μL（含5×105個(gè)細(xì)胞），下室每孔加入500μL含10%新生胎牛血清的培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時(shí)后取出上室，用棉簽拭去上室表面的非侵襲細(xì)胞，然后染色，置于熒光顯微鏡（×200）下拍照，取其中3個(gè)細(xì)胞分布良好的視野計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（±s）表示，采用 t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒載體的鑒定及滴度測(cè)定 挑選陽(yáng)性克隆送上海吉?jiǎng)P公司測(cè)序。鑒定及測(cè)序結(jié)果符合預(yù)期，說(shuō)明合成的IGF-1R shRNA oligo DNA序列插入正確。按逐孔稀釋法，計(jì)算出IGF1R-siRNA重組慢病毒滴度為 3×106TU/μL。

2.2 慢病毒感染H460/ER細(xì)胞 H460/ER細(xì)胞感染重組慢病毒IGF1R-siRNA及其空白對(duì)照慢病毒IGF1R-siControl的效率均達(dá)到90%以上，如圖1。

圖1 H460/ER細(xì)胞感染IGF1R-siControl、IGF1R-siRNA慢病毒效果 （×100）。1A：細(xì)胞感染IGF1R-siControl慢病毒后的明場(chǎng)照片；1B：細(xì)胞感染IGF1R-siRNA慢病毒后的熒光照片；1C：細(xì)胞感染IGF1R-siControl慢病毒后的明場(chǎng)照片；1D：細(xì)胞感染IGF1R-siRNA慢病毒后的熒光照片。

2.3 目的基因IGF-1R抑制效率 qRT-PCR和Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，IGF1R-siRNA慢病毒對(duì)H460/ER細(xì)胞IGF-1R的mRNA和蛋白抑制率分別達(dá)（67.7±2.6）%和（86.6±1.6）%（P＜0.05）。 說(shuō)明構(gòu)建的IGF1R-siRNA慢病毒能高效抑制H460/ER細(xì)胞IGF-1R的表達(dá)。詳見圖2-3。

圖2 qRT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞IGF-1R的mRNA表達(dá)差異

圖3 Western Blot法檢測(cè)各組細(xì)胞IGF-1R的蛋白表達(dá)差異

2.4 抑制IGF-1R表達(dá)對(duì)H460/ER細(xì)胞EGFRTKIs敏感性的影響 MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，siControl H460/ER和siIGF-1R H460/ER細(xì)胞均呈無(wú)限繁殖，它們對(duì)厄洛替尼的增殖作用表現(xiàn)為濃度依賴性 （圖4）；siIGF-1R H460/ER細(xì)胞對(duì)厄洛替尼的敏感性較siControl H460/ER細(xì)胞明顯升高，IC50 值分別為（6.29±1.56）μmol/L 和（65.34±3.30）μmol/L （P＜0.05）， 說(shuō)明抑制 IGF-1R 表達(dá)后，H460/ER細(xì)胞對(duì) EGFR-TKIs的耐藥性顯著降低。

圖4 MTT法檢測(cè)不同濃度厄洛替尼分別作用72小時(shí)后對(duì)siControl H460/ER和siIGF-1R H460/ER細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

2.5 抑制IGF-1R 表達(dá)對(duì)H460/ER細(xì)胞IGF-1R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 靶向抑制IGF-1R后，H460/ER細(xì)胞中EGFR蛋白及其磷酸化表達(dá)未見明顯變化 （灰度未見明顯變化，P＞0.05），而IGF-1R蛋白及其磷酸化表達(dá)顯著降低（灰度明顯降低，P＜0.05），p-AKT 和 p-ERK 表達(dá)亦下降（灰度較對(duì)照組下降，P＜0.05）。詳見圖5。

圖5 Western Blot法檢測(cè)各組細(xì)胞IGF-1R、EGFR、AKT和ERK及其磷酸化水平的表達(dá)

2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力的變化 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siControl H460/ER和siIGF-1R H460/ER細(xì)胞劃痕的兩邊緣距離分別為（5.5±0.5）mm 和（8.9±0.7）mm。相比對(duì)照組 siControl H460/ER，siIGF-1R H460/ER細(xì)胞兩邊緣距離延長(zhǎng) 61%（P＜0.05）（圖6）。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siControl H460/ER和siIGF-1R H460/ER細(xì)胞穿過(guò)Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)分別為（574±33）個(gè)和（179±13）個(gè)，siIGF-1R H460/ER細(xì)胞穿過(guò)Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)為siControl H460/ER 的 69%（P＜0.05）（圖 7）。 上述結(jié)果說(shuō)明，抑制IGF-1R后，非小細(xì)胞肺癌H460/ER細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯減弱。

圖6 抑制IGF-1R后H460/ER細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力變化。6A：劃痕實(shí)驗(yàn)（×40）；6B：Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)（×200）。

圖7 siIGF-1RH460/ER細(xì)胞較siControlH460/ER細(xì)胞侵襲能力明顯減弱。7A：siControlH460/ER細(xì)胞穿過(guò)Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)；7B：siIGF-1R H460/ER細(xì)胞穿過(guò)Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)。

3 討論

非小細(xì)胞肺癌對(duì)EGFR-TKIs獲得性耐藥的主要機(jī)制為T790M突變和c-MET基因擴(kuò)增，兩者占所有非小細(xì)胞肺癌對(duì)EGFR-TKIs獲得性耐藥機(jī)制的60%左右[5]，但目前仍有約40%的NSCLC的EGFRTKIs獲得性耐藥機(jī)制尚未明確。既往研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在NSCLC對(duì)EGFR-TKIs獲得性耐藥過(guò)程中起重要作用[3-4]。IGF-1R是一種跨膜酪氨酸蛋白激酶受體，表達(dá)于多種類型細(xì)胞的表面，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、抗凋亡起著調(diào)控作用。它與配體結(jié)合后激活2條主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：PI3K-AKT信號(hào)通路和ERK/MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂和生長(zhǎng)[3]。IGF-1R在多種腫瘤中表達(dá)，它在肺癌等惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[6]。

本研究利用RNAi技術(shù)[7]成功構(gòu)建穩(wěn)定抑制IGF-1R表達(dá)的H460/ER細(xì)胞株。研究發(fā)現(xiàn)，靶向抑制IGF-1R后，H460/ER細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs敏感性顯著升高，siIGF-1R H460/ER細(xì)胞對(duì)厄洛替尼的IC50僅為對(duì)照組siControl H460/ER細(xì)胞的1/10。說(shuō)明靶向抑制IGF-1R逆轉(zhuǎn)了H460/ER細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs的獲得性耐藥。對(duì)IGF-1R信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)變化的研究顯示，與siControl H460/ER細(xì)胞相比，siIGF-1R H460/ER細(xì)胞的IGF-1R蛋白及其磷酸化表達(dá)明顯降低，p-AKT和p-ERK水平下降，而EGFR蛋白及其磷酸化未出現(xiàn)明顯變化。表明靶向抑制IGF-1R后，其下游PI3K/AKT和MAPK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受到抑制。此外，劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與siControl H460/ER細(xì)胞相比，siIGF-1R H460/ER的轉(zhuǎn)移侵襲能力大幅減弱，說(shuō)明靶向抑制IGF-1R可減弱H460/ER細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。已有研究證實(shí)，腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)[8]，而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在IGF-1R介導(dǎo)的NSCLC對(duì)EGFR-TKIs獲得性耐藥機(jī)制中起著重要作用[9]。因此，腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的減弱很可能也參與了逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌對(duì)EGFR-TKIs的耐藥。鑒于IGF-1R通過(guò)與配體結(jié)合激活2條主要的信號(hào)通路 （PI3K/AKT和MAPK/ERK）而發(fā)揮細(xì)胞效應(yīng)[10]，本研究結(jié)果也已證實(shí)抑制IGF-1R表達(dá)能逆轉(zhuǎn)H460/ER細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs的獲得性耐藥及減弱細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，說(shuō)明靶向抑制IGF-1R表達(dá)很可能通過(guò)阻斷其下游PI3K/AKT和MAPK/ERK信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而逆轉(zhuǎn)H460/ER細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs的獲得性耐藥。

本研究?jī)H對(duì)一種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞作了研究，有待在多株非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中加以證實(shí)，且IGF-1R信號(hào)通路交錯(cuò)復(fù)雜，它參與介導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌EGFR-TKIs獲得性耐藥機(jī)制亦尚未完全闡明，有待進(jìn)一步研究。