基于生物質譜技術解析食源性糖蛋白糖基化位點的研究進展

趙文竹,薛思宇,陳月皎,張宏玲,于志鵬,勵建榮,*,劉靜波

(1.渤海大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121013;2.吉林大學營養與功能食品研究室,吉林長春 130062)

糖蛋白是蛋白質分子和糖鏈通過糖苷鍵相連的一類復合物[1],廣泛存在于動物的體細胞和植物的細胞壁、細胞膜和細胞質中。糖蛋白因具有多糖和蛋白質的部分性質,部分糖蛋白可以溶于水、酸、堿、鹽溶液和有機溶劑中。隨著對糖蛋白研究不斷深入,糖蛋白被定義為由比較短并且一般帶有分支的寡糖鏈和多肽在糖苷轉移酶的作用下,通過糖苷鍵共價連接所形成的結合蛋白[2]。

糖蛋白是生物體內重要的生物大分子,可以參與細胞膜的形成,作為識別位點參與細胞間信息交流,同時還是抗體的重要組成成分[3]。糖蛋白對生長發育、細胞識別、細胞分化、信息傳遞和免疫調節均起著至關重要的作用[4]。隨著研究的不斷深入,糖蛋白的功能越來越多的被發現,糖蛋白的價值也逐漸得到肯定。研究發現食源性糖蛋白具有抗氧化活性、免疫活性和抗腫瘤活性[4]。同時,糖蛋白對人體具有極高的營養價值和保健效果,其廣泛分布在中草藥[5-6]、菌體[7]、藻類[8]、禽畜類[9]以及大宗作物中[10]。

糖蛋白的組成結構受糖鏈以及糖基化位點兩方面因素影響,糖鏈對蛋白質的功能起到輔助和修飾作用,主要通過以下兩種方式:一種是影響分子內的作用,如蛋白質的折疊方式;另一種是影響分子間的作用,如細胞的粘附作用和抗原的結合。糖鏈結構的微小差異可能導致糖蛋白的功能發生巨大變化。糖鏈結合到蛋白質氨基酸殘基的過程,屬于非模版驅動,且糖鏈具有不均一性[11],同一糖鏈分子式中所表示的結構較多,比如三個己糖組成的聚糖,其可能的序列會有26000多種[12]。糖鏈的單糖組成、數量關系、排列的方法和連接的位置都會造成糖鏈結構的差異,進而影響糖蛋白的功能。同時,蛋白質多肽鏈上發生糖基化的位點也會影響糖蛋白的性質。研究表明雞蛋清中卵粘蛋白的高度糖基化是產生蛋白質間粘度的主要原因,發生甘露糖基化的雞蛋清蛋白和卵白蛋白可以減輕人體對雞蛋的過敏反應[13]。

本文對糖蛋白糖基化類型、糖基化解析方法以及生物質譜在糖基化研究中的應用進行歸納和總結,旨在為通過生物質譜技術確定糖基化位點的策略提供參考,并為深入研究食源性糖蛋白的性質和功能提供理論基礎。

1 糖蛋白的糖基化類型

糖蛋白的糖基化類型分為:N-糖基化、O-糖基化以及其他類型的糖基化。

目前,對于糖蛋白糖鏈結構的研究主要集中在N-糖基化結構中,由于共同的生物合成途徑,所有N-糖鏈都有一個結構為Man3GlcNAc2的五糖核心,并可根據其附著的單糖如圖1所示[14]分為3類:寡糖甘露糖型糖鏈。其含有兩個N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和數量不確定的甘露糖(Man),有些還會存在部分葡萄糖基(Glc)的殘留;復合型糖鏈。其除了五糖核心外還有數量不定的GlcNAc、半乳糖(Gal)、巖藻糖(Fuc)和N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac),有時還會有N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)殘基;混合型糖鏈。其結合了寡聚半乳糖苷和復合型物種的特征。N-糖基化,起始于細胞中的內質網,完成于高爾基體中,其中聚糖經由GlcNAcβ-糖苷鍵連接到Asn-X-Ser/Thr(有時也是Cys)基序中的天冬酰胺(Asp)基團,其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸[15-16]。He等[17]證明了冬蟲夏草菌絲體中含有N-糖蛋白。

圖1 N-糖鏈結構分類Fig.1 Classification of N-glycan structures

O-糖基化是在高爾基體中進行,最普遍的形式是粘蛋白型O-糖基化,其糖鏈通過GalNAc與絲氨酸(Ser)或蘇氨酸(Thr)殘基發生α-糖基化連接[18]。這些O-連接的糖鏈具有不同的核心結構,包含許多不同的核心區域,圖2為四種最常觀察到的類型[19]。粘蛋白型O-聚糖會在范圍內發生變化,從單個殘基到延伸的寡糖鏈,類似于復合型N-聚糖,可以產生大量結構變體[20]。與N-糖鏈的結構進行比較,O-糖鏈的單糖結構相對比較簡單,但是結構的類型和亞型更為復雜。詹玲等[21]通過β-消除反應使糖蛋白中的糖鏈釋放,吸光度值在240 nm出有變化,鑒定出大豆中含有O-糖蛋白。

圖2 O-糖鏈主要核心結構分類Fig.2 Classification of the main core of O-glycan structures

其它類型的糖基化在食源性糖蛋白中出現極少,主要分為C-糖鏈連接糖蛋白和糖基磷脂酰肌醇化糖蛋白兩種。C-糖鏈連接糖蛋白主要指的是糖鏈與蛋白殘基側鏈吲哚環上的碳原子通過碳碳鍵相連。此類糖基化很少見,僅在為數不多的天然產物中發現[22]。糖基磷脂酰肌醇化主要發生于錨定蛋白,這種糖基化主要影響細胞跨膜傳導[23]。錨定蛋白上的糖鏈通過C-末端與細胞膜上的糖基磷脂酰肌醇化的蛋白相連,將蛋白固定于細胞膜表面,而不跨越其磷脂雙分子層。

2 糖基化位點的解析技術

目前,糖基化位點解析的瓶頸在于:由于糖蛋白的微不均一性,一個糖基化位點上可能存在多個結構不同的糖鏈結構,難以實現糖蛋白整體的結構表征,只能分別從糖基化位點和糖鏈結構兩個方面對糖蛋白結構進行分析。糖基化位點的解析技術主要分為核磁共振光譜技術(NMR)和生物質譜技術。

2.1 核磁共振光譜技術

核磁共振光譜方法能夠對糖鏈的所有結構特征進行完整和明確的闡釋,包括單糖組分、端基構型、單糖之間的連接類型以及它們的構象,還有非糖取代基的位置[24-26]。但NMR仍有一些局限性:NMR靈敏度低,對樣品的純度要求高,需要大量純度較高的樣品量才可以獲得高分辨率光譜,在糖組學領域用到的樣品都是毫克級,因此NMR技術在這一領域很少應用;糖基化位點的確定只能通過得到的糖鏈結構與已知糖蛋白進行比對,對于未知糖蛋白糖基化位點的解析會產生較大的誤差[27]。所以此方法更多的被應用于糖鏈結構的解析,而在N-糖基化位點檢測上則應用較少。

2.2 生物質譜技術

質譜方法能夠高精度的檢測出微摩爾范圍內的質荷比,是糖組學中糖鏈分析和蛋白質組學中糖基化位點鑒定的關鍵技術。質譜儀的選擇和差異主要表現在離子源和質量分析器。

常用離子源包括基質輔助激光解析離子源(MALDI)和電噴霧離子源(ESI)。MALDI的優點是產生單電荷離子,儀器簡單,分析速度快并且對緩沖液、鹽和洗滌劑等低濃度污染物具有穩定性[28-30],但是,這種類型的分析只能提供最可能存在的蛋白結構,不能完整的定義碳水化合物結構。ESI的優點是產生多電荷離子,降低了被測物的質荷比,拓寬了分子量分析的范圍,靈敏度高于MALDI,缺點是檢測中所使用的緩沖劑必須與電離條件相容,因為ESI對污染物的存在十分敏感[31-32]。常用的質量分析器有飛行時間(TOF)、四級桿(Q)、離子阱(IT)、傅里葉變換離子回旋共振(FTICR)和電場軌道阱回旋共振(Obritrap)等[33]。質量分析器的結構和性能不同,而每個方法都有各自的優勢和劣勢,IT可以進行10級分析(MSn),但靈敏度較低且存在低質量端缺失效應;FTICR和Obritrap的分辨率高,可達十萬以上,但掃描時間較長;TOF和Q的分析靈敏度較高,時間短,但只能進行二級質譜分析。

在糖肽整體的檢測中,為實現優勢互補更全面的獲得糖肽的離子譜圖,通常將多個質量分析器串聯,如MALDI-QIT-TOF和MALDI-TOF-TOF,以及將質譜分析器與碰撞誘導裂解(CID)、高能碰撞裂解(HCD)、電子捕獲裂解(ECD)和電子轉移裂解(ETD)等多種質譜碎裂方式配合使用[34-38],可以為數據的分析提供更全面的信息。

核磁共振光譜法雖然可以準確檢測糖鏈的結構,但由于糖鏈部分可能存在多種異構體,對于糖基化位點的分析不準確。相比之下,生物質譜技術的譜圖解析過程繁瑣,與數據庫進行比對的工作量較大,但可以實現對于糖基化位點和糖鏈結構的快速檢測,結果準確。同時生物質譜技術可以從糖肽整體角度對糖蛋白的結構進行表征,可以在保證檢測準確性的同時,簡化實驗的流程。因此,生物質譜技術更廣泛的被應用在糖基化位點和肽段序列的檢測中。

3 生物質譜技術解析糖蛋白糖基化位點的應用

應用生物質譜技術對于糖蛋白整體結構進行研究,主要的研究內容是N-糖基化位點以及發生糖基化的肽段序列兩個方面,研究方法主要有以下兩種。

3.1 基于去糖基化肽段的糖基化位點分析

目前,對于去糖基化后進行糖基化位點確定的方法有兩種,二者在去糖基化的處理方法上基本一致,只是在質譜圖的分析上存在差異。

3.2 基于糖肽的糖基化位點分析

基于糖肽的糖基化位點分析相比于去糖基化的方法,可以在不丟失特異性糖基化信息的前提下,更直接地獲得蛋白質和糖鏈之間的連接信息,并更接近于待測糖蛋白樣品的真實狀態[44]。此方法主要分為兩種。一種為依靠已知譜庫數據進行的數據掃描方式。糖蛋白在被多種蛋白酶聯合切割后,用凝集素對獲得的糖肽進行富集,在液相色譜中進行純化并對所得到的各個單一組分進行質譜解析,即對質譜檢測到的信號最強的母離子峰進行二級質譜分析,得到子離子峰,并對子離子峰進行三級質譜分析,以此類推,再將每級質譜圖中的峰所在質荷比與譜庫進行比較,從而獲得肽段的序列以及糖基化位點。Franc等[45]用伴刀豆球蛋白凝集素(Con A)富集糖肽的策略,分析了豌豆幼苗銅銨氧化酶(PSAO)和小扁豆銅銨氧化酶(LSAO)的糖基化位點,得出了PSAO上有Asn334和Asn558兩個糖基化位點,其中Asn558上有4條糖鏈;LSAO上有一個糖基化位點,上面結合了7條糖鏈。由于糖肽的特殊結構,在質譜檢測中對所使用的串聯質譜儀質量分析器有較高要求,首先,因為糖肽的分子質量比肽段的分子質量大,所以一級質譜的質量分析器要有足夠寬的質量檢測范圍;其次,因為糖苷鍵和氫鍵會在二級質譜中碰撞破裂,所以二級質譜中,糖肽的碎片離子集中在低質量區,這就要求二級質譜的質量分析器要對低質量區全面的覆蓋[46],因此,TOF和FTICR在糖肽的二級質譜分析中較為常用。傅里葉變換離子回旋共振質譜(FTICR-MS)中的CID破碎方式和ETD破碎方式相結合,就可以在不使用PNGase F酶切除糖鏈的情況下,對發生糖基化的肽段序列、糖基化位點和糖鏈結構進行分析,二者破碎方式如圖3[48]。利用離子阱質量分析器進行的質譜檢測,雖然由于糖蛋白的微不均一性,一個肽段所連接的糖鏈可能會存在異構體,導致計量水平低于非糖基化的肽段而不能得到低質量端的碎片信息,卻可以實現多級質譜的分析,如Zhang等[47]利用五級串聯質譜對一種標準糖蛋白進行檢測,在四級譜圖中得到了糖蛋白的肽段序列和糖基化位點,所以此方法可以進行已知糖蛋白高質量端的糖基化位點驗證。

圖3 CID和ETD碎裂規則對比Fig.3 Comparison of CID and ETD fragmentation rules

另一種方法為靶向性掃描,相比于依靠數據的掃描方式,靶向性掃描能獲得更完整的糖肽序列。靶向性掃描的原理是設置前體離子掃描的質譜,根據設定的破碎后的子離子掃描母離子,從而獲得糖肽的結構。Ritchie等[49]設定靶向質荷比204離子和Y1離子的前體離子掃描方式,提高了質譜檢測的靈敏度,同時能鑒定出更多的糖肽異構體。目前,這種方法在食源性糖蛋白的鑒定中尚未有應用記錄,未來可應用在糖蛋白低質量端的糖基化位點驗證。

4 展望

近年來,隨著質譜技術等方法的不斷發展,N-糖基化位點及肽段序列已經可以被準確的檢測出來,但是由于糖鏈的微不均一性,糖基化位點上所連接的糖鏈個數及糖鏈結構尚不明確。目前,對于發生N-糖基化的糖蛋白研究很多,但是由于O-糖基化的結構多變性,導致對O-糖基化糖蛋白的結構研究較少。同時,對于食源性糖蛋白結構影響功能的作用機理尚不清楚。因此,在未來研究中,研究的重點應該側重于對O-糖基化位點與糖鏈結構的研究,闡述和證明食源性糖蛋白能發揮作用的機理及其構效關系等方面為食源性糖蛋白的綜合利用以及新型藥物和保健食品的開發奠定基礎。