多重PCR檢測嬰幼兒配方奶粉中3種食源性致病菌

姜 華,焦 陽,李遠宏,張金鵬

(徐州醫科大學公共衛生學院,江蘇徐州 221004)

嬰幼兒配方奶粉(Powdered Infant Formula,PIF)是指以牛乳(或羊乳)及其加工制品為主要原料,根據配方加入適量的營養素強化劑和其它輔料加工而成的供嬰幼兒食用的粉狀食品[1]。由于新生兒及嬰幼兒免疫系統發育不完善,食用具有質量安全隱患的PIF將可能導致嚴重的不良后果甚至中毒,嚴重時往往會導致死亡[2-3]。

食源性致病微生物是影響PIF安全性問題的一個極其重要的因素。聯合國糧農組織和世界衛生組織(FAO/WHO)專家委員會已將克羅諾桿菌(Cronobacterspp.)、傷寒沙門氏菌(Salmonellaenterica)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、肺炎克雷伯桿菌(Klebsiellapneumoniae)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)和鮑曼不動桿菌(Acinetobacterspp.)等20種細菌列為PIF中可能導致嬰幼兒致病的細菌[4]。我國食品安全國家標準GB 10765-2010《食品安全國家標準嬰兒配方食品》明確規定克羅諾桿菌(原阪崎腸桿菌)、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌是嬰兒配方食品中必檢的3種食源性致病微生物,并且公布了其相應的微生物限量指標[5]。因此,建立一種能夠同時檢出嬰幼兒配方奶粉中克羅諾桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的檢測方法具有重要的公共衛生學意義。

傳統檢測技術已無法滿足政府監管部門和企業快速檢測多種致病微生物的需要,而多重PCR技術具有高通量、檢測速度較快、靈敏度較高、成本較低等優點,在食源性致病微生物快速檢測領域具有廣泛的應用前景[6]。然而基于PCR(Polymerase Chain Reaction)技術而建立的各種檢測方法往往會產生假陽性結果,其中引物特異性差是產生假陽性結果的重要原因之一[7]。本研究利用通過篩選克羅諾桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的特異性引物,建立了一種能夠準確、快速的實現對PIF中上述3種主要食源性致病菌進行同時檢測的多重PCR方法,以期為預防和控制這些食源性致病菌在PIF中的流行,保障PIF安全提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嬰幼兒配方奶粉 荷蘭菲仕蘭坎皮納乳品有限公司;標準菌株 共12株,其中4株由南京農業大學酶工程實驗室饋贈,6株購自中國工業微生物菌種保藏中心,2株由徐州醫科大學環境與健康實驗室保存(詳細信息見表1);LB培養基(胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,氯化鈉5 g/L) 實驗室自配;DL2000 DNA Marker 大連Takara公司;LAmp DNA Polymerase 南京諾唯贊生物科技有限公司;GelRed Nucleic Acid Gel Stain 美國Biotium公司;引物、TE緩沖液、PCR產物回收試劑盒 生工生物工程(上海)股份有限公司。

表1 實驗菌株Table 1 Strains used in this study

DNP9162型電熱恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司;SW-CJ-2FD型超凈工作臺蘇州安泰空氣技術有限公司;Veriti 96 PCR儀 美國ABI公司;5418型小型高速離心機 德國Eppendorf公司;Gel Doc XR凝膠成像儀 美國BIO-RAD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用水煮法[8]提取細菌總DNA,具體操作方法如下:將菌株接種于LB培養基中37 ℃過夜培養。取過夜培養液1 mL于12000 r/min條件下離心5 min,棄上清液,再用1 mL生理鹽水洗滌沉淀一次,于12000 r/min條件下離心5 min。棄上清液,加入200 μL含1% Triton X-100(V/V)的10 mmol/L,pH7.6的TE緩沖液重懸沉淀,煮沸10 min后立即放入-20 ℃冰箱冷凍30 min,室溫融化后于12000 r/min離心5 min,取上清液用于PCR擴增。

1.2.2 引物合成 通過查閱文獻資料,選取9對引物,引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物的序列及PCR產物片段長度見表2。

表2 本研究中使用的引物Table 2 Primer sequences used for PCR amplification in this study

1.2.3 單重PCR驗證引物特異性 以表3中標準菌株的基因組DNA為模板,分別對上述9對引物進行引物的特異性驗證。PCR反應體系:10×LAmp buffer 5 μL,Mg2+濃度1.5 mmol/L,引物各0.2 μmol/L,基因組DNA模板1 μL,5 U/μL LAmp DNA Polymerase 0.5 μL,加雙蒸水補足至50 μL。PCR反應條件:95 ℃預變性3 min;95 ℃變性30 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30個循環;72 ℃延伸7 min?？瞻讓φ諡榻洔缇幚淼碾p蒸水替代基因組DNA。PCR反應結束后取7 μL反應產物于2%瓊脂糖凝膠電泳分析各引物的特異性。

1.2.4 多重PCR條件的確定 以標準菌株阪崎克羅諾桿菌CICC21560、腸炎沙門氏菌CICC21482、金黃色葡萄球菌ATCC29213基因組DNA為模板構建多重PCR反應體系。多重PCR反應基本體系:10×LAmp buffer 5 μL,Mg2+濃度1.5 mmol/L,特異性引物對(OmpA、invAF1和clfA)的上下游引物各0.2 μmol/L,基因組DNA模板各1 μL,5 U/μL LAmp DNA Polymerase 0.5 μL,加雙蒸水補足至50 μL。PCR反應基本條件:95 ℃預變性3 min;95 ℃變性30 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30個循環;72 ℃延伸7 min。在此條件的基礎上分別對多重PCR反應的退火溫度(51～61 ℃)、Mg2+濃度(0.25～3.00 μmol/L)和引物濃度(100～800 nmol/L)等多重PCR擴增條件進行優化。PCR反應結束后取7 μL PCR反應產物于2%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.5 多重PCR反應的特異性 以9株標準菌株的基因組DNA為模板,以優化后的多重PCR反應體系及條件進行多重PCR,瓊脂糖凝膠電泳觀察分析是否有特異性擴增產物以及產物的大小。PCR產物經DNA產物回收試劑盒純化回收后送至生工生物工程(上海)股份公司測序以驗證擴增結果的準確性。

1.2.6 多重PCR反應靈敏度 將菌體濃度均為108CFU/mL(平板計數法測定)的阪崎克羅諾桿菌CICC21560、腸炎沙門氏菌CICC21482、金黃色葡萄球菌ATCC29213的菌懸液混合后進行10倍系列梯度稀釋,以煮沸法提取DNA,然后按照優化后多重PCR反應體系進行PCR擴增以確定其靈敏度。

1.2.7 人工污染PIF樣品檢出限的確定 取25 g經國家標準檢測[16-18]的不含克羅諾桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的PIF,溶于225 mL無菌生理鹽水中,分別加入上述3種目標菌使其終濃度達到108CFU/mL,再進行10倍系列梯度稀釋至濃度為101CFU/mL。按照煮沸法提取DNA并進行多重PCR檢測以確定人工污染PIF樣品中多重PCR反應的靈敏度。

1.3 數據處理

PCR擴增產物凝膠電泳圖譜均由Bio-Rad公司的Gel Doc XR凝膠成像系統產生,后由Photoshop 7.0進行處理。

2 結果與分析

2.1 引物特異性

以表3中的標準菌株的基因組DNA為模板進行單重PCR擴增以驗證引物的特異性,結果如表3所示。由表3可知OmpA、invAF1、clfA和nuc4對引物特異性較好,但由于nuc基因的擴增產物只有173 bp,而易受PCR反應的非特異性擴增條帶干擾,不利于獲得明確的檢測結果。因此,本研究最終選取OmpA、invAF1和clfA 3對引物為多重PCR引物組合。

表3 引物特異性測試Table 3 Specificity of primers used in this study

2.2 多重PCR反應條件確定

2.2.1 退火溫度的優化 當退火溫度設置為51、53、55、57、59和61 ℃時,多重PCR反應均能擴增出3條特異性目標條帶,其中退火溫度為55 ℃時特異性目標條帶最為清晰(圖1)。因此,將多重PCR反應的最佳退火溫度確定為55 ℃。

圖1 多重PCR反應退火溫度的優化Fig.1 Optimization of annealing temperature of multiplex PCR system注:M:DL2000 DNA ladder marker;1～6:51、53、55、57、59、61 ℃。

2.2.2 鎂離子濃度的優化 在最佳退火溫度(55 ℃)條件下,將多重PCR基本反應體系中Mg2+濃度設置為0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 和3.00 mmol/L時進行多重PCR擴增,并進行瓊脂糖凝膠電泳分析。由電泳圖譜可知，當Mg2+濃度大于等于1.0 mmol/L時，均可檢出多重PCR反應體系中擴增出的特異性目標條帶，尤其是當Mg2+濃度為2.00 mmol/L時特異性目標條帶最為清晰(圖2)。因此，確定多重PCR反應體系的最佳Mg2+濃度為2.00 mmol/L。

圖2 多重PCR反應體系鎂離子濃度優化Fig.2 Optimization of Mg2+ concentration of multiplex PCR system注:M:DL2000 DNA ladder marker;1～7:0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mmol/L。

2.2.3 引物濃度的優化 在最佳退火溫度(55 ℃)和最佳Mg2+濃度(2.00 mmol/L)條件下,將多重PCR基本反應體系中引物濃度分別設置為100、200、300、400、500、600、700和800 nmol/L條件下進行多重PCR擴增,結果表明當各引物濃度大于400 nmol/L后,特異性目標條帶均可同時檢出且目標條帶清晰(圖3)。因此,將多重PCR反應的最佳引物濃度確定為400 nmol/L。

圖3 多重PCR反應體系引物濃度的優化Fig.3 Optimization of primers concentration of multiplex PCR system注:M:DL2000 DNA ladder marker;1～8:100、200、300、400、500、600、700、800 nmol/L。

2.3 多重PCR反應特異性

為了測試多重PCR反應的特異性,將供試標準菌株的基因組DNA在最優條件下進行擴增,結果如圖4所示。陽性對照菌株腸炎沙門氏菌CICC21482、金黃色葡萄球菌ATCC29213、阪崎克羅諾桿菌CICC21560、鼠傷寒沙門氏菌CVCC3384、金黃色葡萄球菌ATCC10384和穆汀斯克羅諾桿菌CICC21563均能擴增出相應特異性基因片段,且無非特異性擴增;而陰性對照菌株致病性大腸埃希氏菌O26∶K60 CICC 10372、大腸埃希氏菌O157∶H7 CICC 10907、產腸毒素大腸埃希氏菌O78∶K80CICC 10413、單增李斯特菌CICC21633、CICC21634和CICC21662以及空白對照均無非特異性擴增(圖4),表明本研究建立的多重PCR檢測體系具有較好特異性。此外,將PCR產物測序后獲得的基因序列在Genbank數據庫中進行Blast比對分析,結果表明PCR產物均為對應菌株的目的基因序列,從而進一步證實了擴增結果的準確性。

圖4 多重PCR反應特異性測試Fig.4 Specific test of multiplex PCR system注:M:DL2000 DNA ladder marker;1:陰性對照;2:腸炎沙門氏菌CICC21482+金黃色葡萄球菌ATCC29213+阪崎克羅諾桿菌CICC21560;3:腸炎沙門氏菌CICC21482;4:金黃色葡萄球菌ATCC29213;5:阪崎克羅諾桿菌CICC21560;6:鼠傷寒沙門氏菌CVCC3384;7:金黃色葡萄球菌ATCC10384;8:穆汀斯克羅諾桿菌CICC21563;9:致病性大腸埃希氏菌O26∶K60 CICC 10372;10:大腸埃希氏菌O157∶H7 CICC 10907;11:產腸毒素大腸埃希氏菌O78∶K80CICC 10413;12:單增李斯特菌CICC21633;13:單增李斯特菌CICC21634;14:單增李斯特菌CICC21662。

2.4 多重PCR反應靈敏度

利用本研究建立的多重PCR檢測體系進行靈敏度實驗,結果如圖5所示。阪崎克羅諾桿菌CICC21560、腸炎沙門氏菌CICC21482、金黃色葡萄球菌ATCC29213在107～102CFU/mL濃度下均可同時擴增出清晰的條帶,而濃度為101CFU/mL時則無清晰的目標條帶,因而確定多重PCR反應的檢出限為102CFU/mL。

圖5 多重PCR反應靈敏度測試Fig.5 Sensitivity test of multiplex PCR system注:M:DL2000 DNA ladder marker;1:空白對照;2～8:107、106、105、104、103、102、101 CFU/mL;圖6同。

2.5 人工污染奶粉檢出限

利用本研究建立的多重PCR檢測體系檢測人工污染奶粉中的阪崎克羅諾桿菌CICC21560、腸炎沙門氏菌CICC21482、金黃色葡萄球菌ATCC29213,結果如圖6所示。3種目標菌在奶粉中的檢出限為103CFU/g。

圖6 人工污染PIF中主要食源性致病菌的檢出限Fig.6 Detection limits of the multiplex PCR for pathogenic bacteria in PIF

3 結論與討論

本研究建立了一種能夠同時檢測PIF中克羅諾桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的多重PCR檢測方法,該方法具有檢測速度快、特異性好的優點。優化后多重PCR檢測體系的最佳退火溫度為55 ℃,最佳Mg2+濃度為2.00 mmol/L,最佳引物濃度為400 nmol/L。在優化條件下,多重PCR反應體系可同時檢測3種致病菌的靈敏度為102CFU/mL,在人工污染PIF中同時檢測3種致病菌的檢出限為103CFU/g。食品安全國家標準GB 10765-2010《食品安全國家標準嬰兒配方食品》中要求不得檢測克羅諾桿菌和沙門氏菌,金黃色葡萄球菌的微生物限量為10 CFU/g[5]。相比較而言,本研究建立的多重PCR檢測體系尚無法達到其要求,但可通過增菌培養來提高待檢食品中目標菌含量的方法來實現對克羅諾桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的檢測。

近年來,PIF中存在的克羅諾桿菌、傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌污染引起了人們的廣泛關注[19-21],但是針對克羅諾桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌3種致病菌的多重PCR檢測方法尚鮮見報導。此外,本研究采用水煮法提取細菌基因組DNA,具有簡便、快速、并可顯著降低檢測成本等優點。本研究初步建立了快速檢測嬰幼兒奶粉中克羅諾桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的多重PCR體系,實現了對3種食源性致病菌DNA的同步快速擴增,為PIF中克羅諾桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的檢測提供了快速、靈敏、特異的檢測方法,具有重要的公共衛生學意義。