納豆粉與紅曲粉組合對高脂小鼠的降脂效果

王素貞,黃占旺,黃永平,陳佳妮

(江西農業大學食品科學與工程學院,江西省天然產物與功能食品重點實驗室,江西南昌 330045)

高脂血癥是由各種原因導致機體內脂肪代謝的不平衡甚至是紊亂造成的,與心血管疾病、糖尿病、動脈粥樣硬化和肥胖等密切相關[1-2]。目前國內外用于治療高脂血癥的藥物主要有他汀類[3]、貝特類[4]、煙酸[5]和膽汁酸多價螯合劑[6],已被證明具有確切的降脂作用。然而,因為長期使用這類藥物造成的肝腎毒性[7]、橫紋肌溶解[8]和高血糖[9]等副作用,有些患者對其不耐受,所以近年來預防和治療血脂異常具有輔助降血脂作用的保健食品得到了明顯的關注。

納豆凍干粉中含有納豆激酶、異黃酮、超氧化物歧化酶、維生素等活性物質,具有抗氧化、溶血栓、抗腫瘤等生物功能。研究[10-12]發現納豆凍干粉能夠降低膽固醇和甘油三酯水平,可用于預防與治療心血管疾病。紅曲粉中有效的降脂活性成分為莫奈可林K,其能夠抑制TC的合成,降低TC水平和提高HDL-C水平[13-14]。充分發掘兩者組合配方的降脂效果,對于開發功能性保健食品具有重要的現實意義,但各組合配制濃度對小鼠的降脂活性作用尚未見報道。因此,本文以高脂肪飲食誘導的高脂小鼠為模型,探討納豆凍干粉和紅曲粉組合對小鼠的降脂效果,有助于開發調節高脂血癥的健康食品。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

納豆凍干粉 2×1011CFU/g,實驗室自制;紅曲粉 福建購買的紅曲米經高速粉碎機粉碎;KM小鼠 清潔級,雌性,25～30 g,許可證號(SCXK(湘)2016-0002),湖南斯萊克景達實驗動物有限公司;滅菌動物飼料 許可證號(SCXK(湘)2014-0002),湖南斯萊克景達實驗動物有限公司;精制豬油 河南眾品食業股份有限公司;膽固醇、脫氧膽酸鈉 北京索萊寶科技有限公司;甲基硫氧嘧啶 阿拉丁(上海)試劑公司;丙二醇、吐溫-80 西隴化工股份有限公司;血清膽固醇(TC)試劑盒、甘油三酯(TG)試劑盒、高密度蛋白-膽固醇(HDL-C)試劑盒 南京建成生物有限公司;蛋白質質量測定試劑盒 北京索萊寶科技有限公司。

AUY120型電子天平 日本SHIMADZU公司;TGL-20000-cR離心機 上海安亭科學儀器廠;Multiskan MK3酶標儀 美國Thermo electron公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 脂肪乳劑的制備 稱取25.00 g豬油、10.00 g膽固醇、1.00 g甲基硫氧嘧啶于200 mL的燒杯中,加熱攪拌混勻加入25.0 mL吐溫-80,混勻后制成油相;另精確稱取2.00 g脫氧膽酸鈉于另一100 mL燒杯中,加入20.0 mL 1,2-丙二醇和60.0 mL蒸餾水,將其置于電爐上攪拌加熱至完全溶解,此時制成另一相—水相。放冷至一定溫度后將制備好的水相邊攪拌邊加入到油相中,充分攪拌均勻至乳白色,即得到脂肪乳劑,封口密閉放置-20 ℃凍存備用。

1.2.2 實驗分組 將體重為25～30 g成年的KM小鼠統一在溫度22～25 ℃、濕度40%～60%、光照比50%的環境下適應性飼養3d,按體重隨機均衡分為8組,每組10只。動物體內實驗分組和受試物的分配情況如表1。

表1 實驗分組與受試物Table 1 The experimental groups and test sample

1.2.3 高脂模型建立與小鼠灌胃 除對照組外,其余小鼠組每天上午均灌胃給予0.2 mL/10 g的脂肪乳劑,按照上述表1每天下午對小鼠灌胃20 mL/kg BW的受試物或者溶劑(生理鹽水),每天按此法持續灌胃30 d。

1.2.4 檢測指標

1.2.4.1 形態觀察與體重變化 觀察灌胃期小鼠的精神狀態、活動情況、體重、體毛、飲食等;每兩天稱重,記錄小鼠實驗期間體重變化并同時測定小鼠的攝食量。

1.2.4.2 器官指數 小鼠末次灌胃后禁食18 h,自由飲水,稱重,乙醚處理后心室穿刺取血,4 ℃下2000 r/min離心15 min分離血清,分裝冷凍保存備用。對小鼠進行解剖,肉眼觀察小鼠體內脂肪沉積情況及臟器變化情況,取肝臟和體脂(腎和性腺周圍脂肪墊組織),無菌生理鹽水沖洗后吸干水分快速稱重,計算肝體比、脂肪系數。其計算公式為:

體脂(g)=腎周圍脂肪+性腺周圍脂肪

肝體比(%)=肝臟重量/體重×100

脂肪系數(%)=脂肪總重/體重×100

1.2.4.3 血清各指數測定 將1.2.4.2保存的血清參照試劑盒說明書進行TC、TG、HDL-C含量的測定。計算動脈粥樣硬化指數AI=(TC-HDL-C)/HDL-C。

1.2.4.4 肝臟中TC、TG含量的測定 用0.9%生理鹽水將肝臟制備成組織勻漿,參照試劑盒說明書測定其小鼠肝臟TC、TG水平。

1.3 統計學分析

采用DPS數據分析軟件進行方差分析,統計計算結果以均值±標準差表示,并用Duncan’s新復極差法進行均值多重比較。

2 結果與分析

2.1 日常活動狀況

實驗期間,各組小鼠精神狀況良好,無腹瀉、便血等異常疾病的發生,皮毛光潔、緊貼于體表,行動反應迅速敏捷;生長狀態良好,除空白對照組外,其余各組的小鼠體型上要稍大些。

2.2 小鼠體重變化

由表2可見,與對照組相比,其余各組小鼠體重增長有顯著性差異(p<0.05),說明高脂血癥小鼠在體重增長上快于正常小鼠,因脂肪乳劑的營養高于其他物質;與高脂模型組相比,各藥物劑量組小鼠的體重增長無顯著性差異(p>0.05),說明各受試物對小鼠體重的增長無影響。

表2 受試物對小鼠體重的影響Table 2 Effects of test sample on weight of

2.3 對小鼠肝體比、體脂、脂肪系數的影響

肝體比反映各受試物對小鼠肝臟的損害程度,體脂與脂肪系數聯合反映了高脂飲食和受試物對小鼠脂肪堆積程度的影響。由表3可知，從肝體比上看,各組均無顯著性差異,但納豆粉組、紅曲粉組和復合物組1～4均稍低于高脂模型組,稍微緩解小鼠肝臟腫大程度。

表3 受試物對肝體比、體脂和脂肪系數的影響Table 3 Effects of test sample on liver coefficient,fat weight and coefficient of

在小鼠體脂重量相比下,各組的體脂均極顯著高于對照組小鼠(p<0.01),表明脂肪乳劑能夠增加小鼠的體內脂肪,造模成功;與高脂模型組相比,復合物組4顯著性降低(p<0.05),表明高劑量的納豆粉和紅曲粉能夠降低高脂小鼠的體內脂肪。

從脂肪系數上看,各組與對照組相比均具有極顯著性(p<0.01),明顯高于正常小鼠的脂肪系數;與模型組相比,紅曲粉組和復合物組3均顯著低于高脂模型小鼠的脂肪系數(p<0.05),復合物組4極顯著性低于高脂模型小鼠的脂肪系數(p<0.01);而與紅曲粉組相比,復合物組4極顯著性低于紅曲粉組的脂肪系數(p<0.01)。

2.4 血清各指數水平

由表4可知，與對照組相比,高脂模型組小鼠的血清TC、HDL-C具有極顯著性差異(p<0.01),血清TG具有顯著性差異(p<0.05),TC和TG均有所增加,HDL-C則降低,表明脂肪乳劑能夠調節小鼠血清的脂質水平,達到高脂狀態,即造模成功。

表4 受試物對小鼠血清TC、TG、HDL-C和AI的影響Table 4 Effects of test sample on TC,TG,HDL-C,AI of mice

從TC水平上看,灌胃受試物后,紅曲粉組、復合物組2、復合物組3、復合物組4均要極顯著性地低于高脂模型組小鼠(p<0.01);與紅曲粉組相比,復合物組4顯著性地降低(p<0.05),表明不同濃度的納豆粉和紅曲粉在降低小鼠TC水平上發揮作用。

從TG水平上看,紅曲粉組、復合物組2、復合物組4顯著性地低于高脂模型組小鼠(p<0.05);而且與納豆粉組相比,復合物組4的TG水平顯著性降低(p<0.05);說明紅曲粉、納豆粉和紅曲粉組合能夠降低小鼠TG水平。

從HDL-C水平看,紅曲粉組、復合物組2、復合物組4均要極顯著性地高于高脂模型組小鼠(p<0.01);與納豆粉組相比,紅曲粉組、復合物組2、復合物組4均極顯著性升高(p<0.01);說明紅曲粉對提高小鼠HDL-C水平有顯著效果。

而且,高脂模型組小鼠的AI值與對照組相比具有極顯著性(p<0.01),高出幾倍,說明灌胃脂肪乳劑可以顯著性地增加小鼠患動脈粥樣硬化相關疾病的概率;納豆粉組與復合物組1與高脂模型組小鼠相比,AI值無顯著性差異,而其余各組小鼠的AI值均顯著性降低,表明納豆粉和紅曲粉組合能夠減少其疾病的發生概率。

2.5 對小鼠肝臟脂質的影響

由表5可知，高脂模型組小鼠肝臟的TC、TG水平均極顯著高于對照組小鼠(p<0.01),顯示出脂肪乳劑也能夠使得小鼠的肝臟脂質水平發生變化,高脂模型造模成功;紅曲粉組、復合物組2、復合物組4小鼠的TC水平均顯著低于高脂模型組小鼠的水平(p<0.05);復合物組4的TG水平顯著低于高脂模型組小鼠的水平(p<0.05)。這表明納豆粉和紅曲粉以適當比例的組合可以輔助降低小鼠肝臟TC、TG水平,發揮降脂作用。

表5 受試物對小鼠肝臟TC和TG的影響Table 5 Effects of test sample on TC and TG level of

3 討論

高脂血癥尤其是血清總膽固醇升高是引起心血管疾病的危險因素,全世界每年估計造成440萬人的死亡[15]。高脂血癥狀態是建立在以前有相似實驗研究模型之上的[16-18]。這些研究是在體重為25～30 g雌性昆明小鼠中進行的,并且給予高脂飲食一個月。在這些研究中,正常飲食小鼠平均血清總膽固醇水平為1～2 mmol/L,高脂小鼠血清總膽固醇水平為2～3 mmol/L。這與我們研究中高脂模型組小鼠血清膽固醇水平(2.557±0.169) mmol/L一致。

有相當數量的人口、動物研究報道了紅曲米的降脂作用,而且幾個世紀以來已經在我國被用作膳食補充劑和草藥的紅曲米作為治療高脂血癥的藥物[19]。紅曲米的成分包括莫納可林(洛伐他汀)等被認為在高脂血癥的治療中發揮重要作用[20]。臨床研究表明,紅曲米有將血清LDL-C水平降低10%～33%的可能[21-22]。雙盲隨機對照實驗顯示,與安慰劑相比,紅曲米或其提取物可降低總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平[23-24]。一項隨機對照動物實驗表明,紅曲米可防止喂食高脂肪飲食的小鼠發生肥胖、高脂血癥和脂肪肝[25]。因此,紅曲米不僅具有治療潛力,而且具有預防高脂血癥和肥胖癥的潛力。動物研究表明,紅曲米提取物在實驗模型中能夠降低脂質過氧化水平。印度品種紅曲米水提取物的使用降低了脂質過氧化水平,并增加依賴于高膽固醇飲食喂養鏈脲霉素(STZ)誘導的糖尿病大鼠的還原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶劑量的水平[26]。實驗性動脈粥樣硬化兔模型中,紅曲米能夠降低血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和血液丙二醛水平[27]。在使用紅曲米的許多動物與人體實驗研究顯示,膽固醇和甘油三脂水平一致下降。

謝嵩等[28]研究了不同劑量的納豆激酶凍干粉對高脂模型大鼠的降脂功能,測定了大鼠的血清TC、TG水平,發現各劑量的納豆激酶凍干粉均能顯著地降低TC、TG水平,其表明納豆激酶具有降脂作用。袁淑云等[29]通過自由進食高脂飼料造成的高脂小鼠模型,探究納豆激酶提取液對小鼠血清TC、HDL-C和AI的影響,結果表明納豆激酶提取液具有預防與降脂作用。張瑩等[30]通過測定家兔血清額TC、TG、LDL-C、HDL-C水平得到納豆激酶對家兔的脂質異常具有顯著的調節和改善作用。段智變等[31]發現納豆提取物能夠降低LDL-C含量而提高HDL-C的含量,使得血清中的血脂水平降低,達到治療效果。各研究表明納豆凍干粉具有降低小鼠、大鼠和家兔血清TC、TG水平的作用。

納豆凍干粉中的異黃酮能夠使LDL受體發生正向調節,使LDL受體增加,從而影響血液膽固醇水平[32-33]。納豆凍干粉的有效成分納豆激酶對降低血脂功能起主要作用。納豆激酶參與脂質代謝的調節,通過其對涉及脂質代謝的某些蛋白質靶標的蛋白水解活性。由于酶是反應的生物催化劑,如果在反應中相關酶失活,任何代謝反應都會受到不同程度的影響。紅曲粉的有效成分莫奈可林K抑制HMG-CoA還原酶,使其活性降低,對降低膽固醇水平具有有效作用[34]。因此,兩者組合時在降低血脂功能上能夠起到相互促進作用,相輔相成,從而達到更佳的作用效果。

與這些研究相一致,我們預計與高脂模型組相比,所有實驗組的脂質水平都下降。但發現與紅曲粉組相比,只有高劑量組顯示出較低的脂質水平。這些數據結果表明,紅曲粉、納豆粉均具有降脂作用,而且高劑量的紅曲粉和納豆粉在降脂作用上具有協同作用,共同輔助降脂。

4 結論

通過脂肪乳劑灌胃小鼠,建立高脂小鼠模型。在高脂小鼠基礎上對納豆粉和紅曲粉的降脂功能進行探究,獲得適當比例的復合物對小鼠的降脂活性指標,從而為開發納豆粉與紅曲粉復合物保健品提供研究基礎數據。本文結果表明納豆粉和紅曲粉組合在適當比例下比單獨使用納豆粉、紅曲粉在降低小鼠脂質水平上具有更明顯效果。其對小鼠的體重增量無影響;與高脂模型組相比,高劑量(200 mg/mL)納豆粉和中劑量(100 mg/mL)紅曲粉組合的體內脂肪顯著地低于高脂模型組水平(p<0.05);與高脂模型組相比,納豆粉與紅曲粉組合能夠降低高脂小鼠血清TC、TG 水平,提高HDL-C水平。納豆粉與紅曲粉組合可以輔助降低小鼠肝臟TC、TG水平,發揮降脂作用。綜上結果可知,納豆粉與紅曲粉兩者相輔相成、取長補短,以適當比例組合在降低小鼠血脂方面能夠發揮更加顯著效果,用于預防血脂異常、心血管疾病、動脈粥樣硬化等疾病。