裙帶菜酶解物抗焦慮作用

顏 澤,姜燕蓉,熊笑妍,劉 暢,胡建恩,盧 航,趙 慧

(大連海洋大學食品科學與工程學院,遼寧大連 116023)

焦慮是針對環境變化所產生的一種應激行為,隨著生活節奏的加快,人們承受的壓力日益沉重,焦慮情緒嚴重影響人們正常的生活和工作[1-2]。越來越多的抗焦慮藥物如苯二氮卓類(benzodiazepines)被應用到焦慮癥的治療之中,這些藥物雖然見效快，但同時也存在諸多副作用[3]。食源性天然活性物質具有安全、無毒、副作用小、易吸收等特點,很大程度上可以避免合成類藥物的毒副作用。目前食源性抗焦慮活性的研究主要集中在肽、多酚和多糖類等物質,許多學者進行了初步的探索。如Zhao等從菠菜中分離得到具有抗焦慮效果的肽[4];Cho等研究發現腔昆布(Eckloniacava)多酚提取物具有抗焦慮活性[3];Monteiro等在紅藻(Gracilariacornea)多糖的抗焦慮作用研究中,發現其作用機制可能與γ-氨基丁酸能系統(GABAergic system)有關[5]。以上研究成果說明食源性天然活性物質具有開發抗焦慮保健食品或藥品的潛力,但是具體的作用機理仍需要進一步探討。

裙帶菜(Undariapinnatifida)是我國主要的養殖經濟藻類之一,廣泛分布于我國遼寧、山東、江蘇、浙江等沿海城市,具有食用和藥用價值,享有“海洋蔬菜”的美稱[6]。目前對于裙帶菜生物活性成分的研究主要集中在多糖、肽類以及巖藻黃素等,發現其具有降血脂、降血壓、降膽固醇、抗凝血等多種生理活性[7-10],但是在神經作用尤其是抗焦慮活性方面的研究較少。

本研究通過蛋白酶酶解裙帶菜,考察其酶解物對ICR小鼠在高架十字迷宮(elevated plus maze,EPM)實驗中的行為影響,以及長期灌胃后對小鼠腦組織中神經內分泌物多巴胺(dopamine,DA)和5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)含量的影響,初步探討裙帶菜酶解物的抗焦慮作用,為開發經濟型海洋抗焦慮活性物質提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

裙帶菜 當地海鮮市場(遼寧,大連);安定(diazepam) 純度≥99.0%,日本和光純藥工業株式會社;胃蛋白酶(800～2500 U/mg) 美國Sigma公司;磷酸(PBS)緩沖液 生工生物工程(上海)股份有限公司;DA ELISA試劑檢測盒、5-HT ELISA試劑檢測盒 南京建成生物工程研究所;SPF級雄性ICR小鼠50只,體重(24±2)g,動物及飼料 大連醫科大學SPF動物實驗中心。

BS-224S分析天平 賽多利斯科學儀器有限公司;XM-800Y高速粉碎機 廣州市旭朗粉碎機機械設備有限公司;SYG-2型恒溫水浴鍋 常州朗越儀器制造有限公司;JJ-1型磁力攪拌器 常州國華電器有限公司;PHS-25型pH計 上海雷磁儀器有限公司;MD10透析袋(MWCO=6 kDa) 美國聯合碳化物公司;H-1850R離心機 湘儀離心機儀器有限公司;SCIENTZ-10ND型凍干機 寧波新芝生物科技股份有限公司;玻璃勻漿器 上海雷布斯網絡科技有限公司;SYNERGY H1酶標儀 美國伯騰儀器有限公司;高架十字迷宮 上海軟隆科技發展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 海藻酶解物的制備 新鮮裙帶菜干燥(65 ℃,48 h),高速粉碎機粉碎,與蒸餾水以1∶30 (w/v)混合攪拌,1 mol/L NaOH溶液調節pH至11,3 h后用1 mol/L HCl溶液調節pH至2,加入胃蛋白酶(酶與裙帶菜干粉比1∶20 (w/w)),37 ℃酶解24 h,100 ℃水浴下滅酶10 min,4 ℃、9000 r/min條件下離心30 min,取上清液即裙帶菜酶解液(wakame hydrolysate,WH,留取部分備用),于6 kDa透析袋中用蒸餾水透析3次,每次24 h,最后合并3次透析濾過液(wakame hydrolysate A,WH-A),同時取出透析殘留液(wakame hydrolysate B,WH-B),分別冷凍干燥后稱重備用。

1.2.2 實驗動物及分組 小鼠置于相對濕度40%～70%,溫度(22±2) ℃的12/12 h光暗循環的動物飼養室,自由進食標準鼠糧及飲水。實驗采用健康雄性ICR小鼠50只,隨機分成5組:空白對照(生理鹽水);Diazepam組2 mg/kg;WH組1 g/kg;WH-A組1 g/kg;WH-B組1 g/kg,腹腔注射后進行行為學實驗。行為學實驗完成后繼續按原組別:空白對照組(去離子水);Diazepam組0.3 mg/kg;WH組0.3 mg/kg;WH-A組0.3 mg/kg;WH-B組0.3 mg/kg,進行灌胃,每日灌胃1次,每次0.3 ml,連續灌胃28 d。

1.2.3 EPM實驗 EPM是檢測小鼠焦慮行為的常用方法,利用小鼠對新事物的好奇心理與嗜暗天性之間的探究與回避的沖突行為,通過小鼠在開臂與閉臂內的滯留時間和路徑來評價小鼠的焦慮行為[11]。

實驗參考Zhao等[4]方法,略作調整。提前3 h將小鼠轉移至行為學實驗室,以適應環境。實驗前清潔EPM裝置。小鼠按照不同組別(空白對照組、Diazepam組、WH組、WH-A組、WH-B組)腹腔注射相應物質30 min后,將小鼠放置于EPM裝置開臂與閉臂接合處,小鼠面朝開臂,分別記錄5 min內小鼠進入開臂的次數(open arm entry,OE)和閉臂的次數(closed arm entry,CE)、在開臂滯留的時間(open arm time,OT)和閉臂滯留的時間(closed arm time,CT)、進入開臂與閉臂的總次數(total entry,TE)。分別計算小鼠在開臂中的滯留時間百分比(OT%),OT%=OT/(OT+CT)×100;開臂進入次數百分比(OE%),OE%=OE/(OE+CE)×100;各臂總進入次數(TE),TE=OE+CE。實驗過程中以小鼠四爪全部進入為進臂標準。每次實驗結束后將小鼠放回鼠籠,用70%乙醇將EPM裝置擦拭干凈,并用紙巾擦干。

1.2.4 DA與5-HT含量測定 灌胃28 d后,將小鼠斷頭取腦,用預冷的PBS溶液(pH7.4)清洗表面血跡,用濾紙吸干水分,稱重后放入組織研磨器,并加入PBS溶液在冰浴中將腦組織充分勻漿,勻漿后離心(5000 r/min,10 min,4 ℃)取上清液,立即分裝并放置于-80 ℃冰箱保存備用。采用ELISA法檢測小鼠組織勻漿液中DA和5-HT含量,具體操作方法參照試劑盒說明書進行。

1.3 統計學處理

所有結果都用平均值±標準誤表示,用變異數分析(one way analysis of variance,one way ANOVA)來評估各組間的差異，p<0.05為統計顯著性水平。

2 結果與分析

2.1 EPM實驗

2.1.1 滯留時間的變化 圖1所示為ICR小鼠的OT%。與空白對照組(20.4%±2.8%)相比,WH組和WH-B組的OT%無顯著性差異(p>0.05),而WH-A組小鼠的OT%極顯著(p<0.01)增加,與Diazepam組(p<0.05)具有相同趨勢的作用效果;與Diazepam組(41.4%±8.4%)相比,WH-A組、WH-B組和WH組均無顯著性差異(p>0.05)。Ota等[12]的研究表明具有抗焦慮效果的大豆來源十一肽FLSSTEAQQSY顯著(p<0.05)增加了小鼠的OT%,與本實驗結果相似,說明WH-A組OT%的增加與抗焦慮作用有關。因此推斷裙帶菜酶解液通過透析處理后,分子量小于6 kDa的組分中可能含有抗焦慮活性成分。

2.1.2 進入次數的變化 圖2所示為ICR小鼠OE%。與空白對照組(31.0%±4.4%)相比,WH組(45.2%±5.7%)在開臂中OE%雖有增加的趨勢,但是并未產生顯著性影響(p>0.05)。經過透析處理之后,與空白對照組相比,WH-A組小鼠的OE%極顯著(p<0.01)的增加,WH組和WH-B組小鼠的OE%無顯著差異(p>0.05)。與Diazepam組相比,WH-A組和WH組的OE%未見顯著性差異(p>0.05),但是WH-B組小鼠的OE%出現了極顯著(p<0.01)的減小。Kanegawa等[13]發現抗焦慮肽在小鼠的EPM實驗中顯著增加OT%的同時OE%也會顯著增加(p<0.05),此結果與本實驗結果中WH-A組相似,因此可以判斷WH-A組中含有抗焦慮活性成分。因此,能引起小鼠OE%增加的有效成分集中在分子量范圍在6 kDa以下的組分中,即裙帶菜酶解物具有抗焦慮活性的決定性組分。

圖2 各組小鼠在EPM實驗中開臂進入次數百分比(n=10)Fig.2 OE% of different mice groups in EPM test(n=10)

2.1.3 總行動量的變化 小鼠在EPM實驗中的TE反映小鼠的活躍程度[14]。裙帶菜酶解物各組與空白對照組(18.1%±1.5%)相比均有TE減少的趨勢(圖3),其中WH組和WH-B組的TE均極顯著(p<0.01)減小;與Diazepam組相比,WH-A組的TE顯著(p<0.05)減少,WH組與WH-B組的TE均極顯著(p<0.01)減少。結果表明,裙帶菜酶解物中分子量大于6 kDa的組分中含有影響小鼠行動量的成分,而分子量小于6 kDa的組分對行動量的影響較小。根據Cho等研究結果,海藻中含有催眠作用的成分[15],而與抗焦慮作用相關聯的受體,如5-HT、DA和GABA等同時也是促睡眠或鎮靜的作用受體[15-17],由此推測裙帶菜酶解物各組中可能含有具有催眠作用的成分,從而影響了小鼠的活躍程度。

圖3 各組小鼠在EPM實驗中總行動量的變化(n=10)Fig.3 Changes of TE of different mice groups in EPM test(n=10)

本研究以海洋植物為研究對象,通過EPM實驗結果,發現裙帶菜酶解物WH-A即分子量小于6 kDa的組分對ICR小鼠具有抗焦慮效果,并且對其行動量不產生顯著性影響(p>0.05)。但是WH-A的具體組成成分,以及產生抗焦慮活性有效成分的結構和特性仍需進一步深入研究。

2.2 裙帶菜酶解物對小鼠腦組織中DA和5-HT含量的影響

2.2.1 裙帶菜酶解物對DA含量的影響 DA作為與焦慮相關聯的神經遞質之一,其含量的變化會引起情緒的緊張或放松,因此在對焦慮的研究中常作為檢測指標進行分析[18-19]。圖4為28 d連續灌胃后,各組小鼠腦組織中DA含量的變化情況。結果顯示,與空白組相比,僅Diazepam組DA含量顯著(p<0.05)降低,此結果與Hegarty等研究結果相似,可能是GABA體系參與了DA分泌體系的活動[20]。與空白組相比,裙帶菜酶解物各組中DA含量均無顯著差別(p>0.05),說明裙帶菜酶解物可能與DA體系無關聯性;也可能是酶解物通過消化系統代謝后,未能跨越血腦屏障而對腦組織中DA體系產生影響,因此沒有改變腦組織中DA的分泌量。裙帶菜酶解物對腦組織中DA體系的直接作用仍需進一步探討。

2.2.2 裙帶菜酶解物對5-HT含量的影響 5-HT作為神經遞質,主要分布于腦的松果體和下丘腦,其水平的異常會引起精神類疾病的產生,與抑郁癥、焦慮癥的發病機制密切相關,抗焦慮藥物如氟西汀、帕羅西汀等就是通過抑制5-HT的再攝取,降低5-HT濃度,從而起到抗焦慮作用,達到治療目的[21-23]。長期投喂裙帶菜酶解物后,小鼠腦組織中5-HT含量的變化如圖5所示,與空白組相比,Diazepam組的5-HT含量極顯著(p<0.01)減少,可能是GABA體系對5-HT的合成起到了抑制的作用[24]。同時,與空白組相比,WH-A組的5-HT含量也發生了顯著(p<0.05)降低,但是WH與WH-B組并沒有顯著變化(p>0.05),說明裙帶菜酶解物中分子量小于6 kDa的組分經消化系統代謝后,能夠直接或間接的作用于5-HT關聯受體,抑制小鼠腦組織中5-HT的分泌,產生抗焦慮的作用效果。

圖5 各組小鼠腦組織中5-HT含量的變化(n=10)Fig.5 Changes of 5-HT levels in brain tissue of different mice groups(n=10)

3 結論

本研究通過EPM實驗證實了裙帶菜酶解物WH-A,即分子量小于6 kDa的組分具有抗焦慮活性,其對小鼠腦組織中DA含量未產生顯著性影響(p>0.05),但是降低了小鼠腦組織中5-HT的含量從而改善了小鼠的焦慮程度,因此裙帶菜酶解物的抗焦慮作用機理與5-HT受體相關聯。本研究為裙帶菜中活性成分的研究提供了理論依據,并為海洋生物資源的高值化利用提供了思路。