黑蒜促進血管生成作用

盛文龍,武 云,劉發生,李娟娟,靳 夢,何秋霞,韓 兵,黃金棟,韓利文,*,劉可春,*

(1.齊魯工業大學(山東省科學院)生物研究所,山東省科學院藥物篩選技術重點實驗室,山東省生物檢測技術工程實驗室,山東濟南 250103;2.萊蕪裕源食品有限公司,山東萊蕪 271100)

隨著社會經濟的發展和人口老齡化的加劇,心腦血管疾病已成為當今危害人類健康的重要疾病[1-2],其發病率、致殘率和死亡率遠遠超過傳染病和癌癥,居各類疾病之首。其中缺血性心腦血管疾病具有致殘率高、死亡率高、復發率高、并發癥多的臨床特點[2]。從天然產物中發現和尋找防治缺血性心腦血管疾病的活性物質對于解決這類健康問題意義重大。缺血性心腦血管疾病由血管於塞等引起,嚴重時會導致心腦組織缺血、缺氧而出現組織壞死等,其致死率逐年增高。血管網絡的重建是緩解缺血組織供氧的重要途徑,快速而有效地促進組織血管新生,是缺血性心腦血管疾病治療和防治的新思路。黑蒜是一種新型的大蒜類保健食品,由普通大蒜在高溫、高濕環境下發生酶解和美拉德反應后而成[3]。在保有大蒜原有營養成分和獨特保健功能的基礎上,黑蒜中新功能成分的產生,以及原有鮮大蒜中辛辣感和刺激性氣味的降低,使得黑蒜成為大家喜愛的藥食兼具型新興保健食品[4-6]。現有的文獻表明,黑蒜在抗氧化[7-9]、血脂調節[10-11]等方面具有一定的生物活性。然而,黑蒜對于心血管系統疾病的防治作用還缺乏全面的科學證據。

作為重要的新型模式生物,脊椎動物斑馬魚具有體表透明可視、適合高通量、發育時間短、實驗周期短、實驗用藥少、實驗成本低、體表通透性好、具有脊椎動物大部分組織和器官、與人類基因組同源性高、基因組全系列測序已完成以及多品系轉基因斑馬魚日趨成熟等諸多特點[12-14],斑馬魚已成為構建疾病模型、新藥研發和藥物篩選領域極富利用價值的活體生物實驗模型[15-18]。鑒于斑馬魚與人類具有極為相似的早期心血管發育系統[19],以及可用于造血系統生理和病理功能研究的熒光蛋白標記血管的斑馬魚模型的構建,為促/抗血管生成藥物的篩選提供了有利條件。以flk-1:GFP系轉基因魚為代表的斑馬魚模型,是采用綠色熒光蛋白標記血管內皮生長因子二型受體,借助熒光顯微鏡,人們能夠更加直觀、清楚地觀察到活體斑馬魚胚胎血管發育全程,適用于考察外源性藥物對斑馬魚血管生成的促進或抑制作用,從而對符合要求的促/抗血管生成藥物進行篩選。此外,人臍靜脈內皮細胞為血管內壁與血液間的單層細胞,在維持機體內外環境的穩定中,發揮重要的生理作用。內皮細胞的原代培養簡單、有效,加之人臍靜脈內皮細胞來源于人體,是體外研究心血管系統的重要資源,這使得內皮細胞成為心腦血管疾病研究的良好模型。

本實驗利用斑馬魚血管生成檢測實驗和人臍靜脈內皮細胞增殖檢測實驗,從體內和體外兩方面考察黑蒜對于血管新生的促進作用,旨在為黑蒜價值的深入開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑蒜 萊蕪裕源食品有限公司(批號20170603);綠色熒光蛋白標記血管的flk-1:GFP斑馬魚 山東省科學院斑馬魚藥物篩選平臺;人臍靜脈內皮細胞(HUVECs) 齊氏生物科技公司;DMEM/F12培養基 Hyclone公司;新鮮胎牛血清、0.25%胰酶 Gibco公司;青鏈霉素 上海生物工程技術服務有限公司;酪氨酸激酶抑制劑PTK787[20](又名瓦他拉尼,Vatalanib)、麻醉劑三卡因(tricaine,間氨基苯甲酸乙酯) Sigma Aldrich公司;丹紅注射液 山東丹紅制藥有限公司;鏈霉蛋白酶Pronase(斑馬魚胚胎脫膜劑) Solarbio公司;細胞增殖-毒性檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8) Dojindo公司。

SZX16熒光顯微鏡、DP2-BSW圖像采集系統 日本Olympus公司;斑馬魚養殖飼養設備 北京愛生科技公司;博訊SPX-300B-G型光照培養箱 上海基星生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑蒜提取液的制備 取40 g黑蒜,粉碎后加100 mL蒸餾水,80 ℃條件下提取4 h,過濾,得黑蒜提取液,4 ℃條件下避光保存,備用。

1.2.2 斑馬魚胚胎的制備與藥物處理 雌雄斑馬魚成魚在照明14 h/黑暗10 h恒溫(28 ℃)條件下分開飼養。取性成熟斑馬魚進行交配并獲取胚胎,對受精卵進行消毒和清洗后,加入到斑馬魚胚胎培養用水(5 mmol/L NaCl,0.17 mmol/L KCl,0.4 mmol/L CaCl2,0.16 mmol/L MgSO4)中,置于28 ℃光照培養箱中培養,待用。

取24 hpf(hours post-fertilization,受精后小時)的斑馬魚胚胎進行脫膜(幼魚孵化前的胚胎膜)處理,隨機分組并移入24孔板中,設空白對照組、血管模型組(添加0.2 μg/mL PTK787)、陽性對照組(添加30 μL/mL丹紅注射液,同時添加0.2 μg/mL PTK787)和黑蒜提取液處理組(設有0.2、0.8和3.2 μL/mL的濃度梯度,同時添加0.2 μg/mL PTK787)。每隔24 h換液一次,在28 ℃光照培養箱中培養,并分別于48 hpf時通過熒光顯微鏡觀察斑馬魚節間血管(intersegmental vessel,ISV),72 hpf時觀察斑馬魚腸下靜脈(subintestinalis vessel,SIV)生長情況,通過DP2-BSW圖像采集系統進行數據采集。

1.2.3 人臍靜脈內皮細胞增殖實驗 人臍靜脈內皮細胞來源于正常人臍靜脈血管內膜表面,體外培養并接種于含DMEM/F12完全培養基的96孔板中,保證細胞數目約為6000個/孔,并于含有5% CO2培養箱中37 ℃溫度下培養。待細胞貼壁后,分別加入受試藥物,詳細信息如下:空白對照組(不額外施加任何藥物)、陽性對照組(4.0 μL/mL丹紅注射液)和黑蒜提取液處理組(設有0.2、1.0和5.0 μL/mL的濃度梯度)。待內皮細胞生長至覆蓋培養瓶底面積的60%～80%時,各組同時施加CCK-8溶液,將培養板移入培養箱中繼續培養2 h后,利用分光光度計檢測450 nm處細胞溶液的吸光度值,并以吸光度值的大小代表細胞活性的強弱。

1.2.4 鏡檢 在熒光顯微鏡(SZX16,Olympus)下利用FV10軟件對綠色熒光蛋白標記血管的flk-1:GFP系斑馬魚ISV、SIV進行數據采集,在顯微鏡明場下對細胞增殖實驗中各組細胞形態進行數據采集,上述數據存儲于電腦中。

1.3 數據處理

通過Adobe Photoshop CS3進行圖片尺寸等處理,使用OriginPro 8.0(OriginLab Corp.,Northampton,MA,USA)和Microsoft Excel(Microsoft Corporation,Redmond,WA,USA)進行數據分析和圖像制作。所有統計數據均以平均值(mean)±標準誤(SE)的形式表示,其中,斑馬魚實驗中,各組重復數n=8;細胞活性實驗中,各組重復數n=4。統計學檢驗采用T-Test檢驗和One-way-ANOVA檢驗。

2 結果與分析

2.1 黑蒜提取液對斑馬魚ISV和SIV新生的促進作用

2.1.1 黑蒜提取液對斑馬魚ISV新生的促進作用 經PTK787、丹紅注射液和不同濃度的黑蒜提取液處理的斑馬魚胚胎,通過熒光顯微鏡觀察到的flk-1:GFP系轉基因熒光斑馬魚胚胎ISV的生成情況如圖1所示,空白對照組中ISV從腹側背主動脈(dorsal aorta,DA)或者后主靜脈(posterior cardinal vein,PCV)發出,向背側延伸到達背側縱向血管(dorsal longitudinal anastomotic vessels,DLAV),相鄰ISV間均勻而有序的并排分布,且在拐角處生成側枝。血管模型組中,PTK787的加入使得部分ISV僅僅長出血管芽或者ISV長度偏短,未與DLAV相連,且呈現出血管排列不規律、走向紊亂等特點。

圖1 各組藥物處理后斑馬魚ISV生長情況Fig.1 Angiogenesis of ISVs in zebrafish after drugs treatment注:A～F為各組斑馬魚胚胎ISV典型圖,如箭頭所示,其中A為空白對照組,B為血管模型組,C為陽性對照組,D～F為黑蒜提取液處理組(0.2 μL/mL(圖D)、0.8 μL/mL(圖E)、3.2 μL/mL(圖F))。

如圖2統計結果顯示,PTK787處理斑馬魚24 h后,血管模型組斑馬魚ISV條數顯著(p<0.05)低于空白對照組,這提示PTK787對斑馬魚ISV的發育具有明顯的抑制作用。丹紅注射液及黑蒜提取液的加入,能很好地改善由PTK787引起的上述血管發育不全,并且黑蒜提取液的促血管生成作用呈現出顯著的劑量依賴性,帶有熒光信號的ISV條數隨著黑蒜提取液濃度升高而增加,當黑蒜提取液濃度增加至3.2 μL/mL時,PTK787對ISV熒光信號的抑制作用幾乎消失,提示黑蒜對斑馬魚胚胎ISV的生長起到明顯的促進作用。

圖2 各組藥物處理后斑馬魚ISV生長情況的統計Fig.2 Statistics of angiogenesis of ISVs in zebrafish after drugs treatment注:各組斑馬魚胚胎ISV條數統計圖;*p<0.05對應于空白對照組與血管模型組,#p<0.05對應于給藥組(陽性對照組或者黑蒜提取液處理組)與血管模型組。

2.1.2 黑蒜提取液對斑馬魚SIV新生的促進作用 經血管生成抑制劑PTK787、丹紅注射液和不同濃度的黑蒜提取液處理的斑馬魚胚胎,由熒光顯微鏡觀察并分析flk-1:GFP系轉基因熒光斑馬魚胚胎SIV的生成情況如圖3所示。72 hpf時,空白對照組典型SIV呈整齊的柵欄狀,連續無分枝。血管模型組斑馬魚SIV產生畸形,帶有熒光的血管幾乎完全消失。

圖3 各組藥物處理后斑馬魚SIV生長情況Fig.3 Angiogenesis of SIVs in zebrafish after drugs treatment注:A～F為各組斑馬魚胚胎SIV典型圖,如箭頭所示,其中A為空白對照組,B為血管模型組,C為陽性對照組,D～F為黑蒜提取液處理組(0.2 μL/mL(圖D)、0.8 μL/mL(圖E)、3.2 μL/mL(圖F))。

如圖4統計結果顯示,PTK787處理斑馬魚48 h后,該血管模型組斑馬魚SIV條數顯著低于空白對照組(p<0.05),這提示PTK787對斑馬魚SIV的發育有著明顯的抑制作用。而經丹紅注射液和不同濃度黑蒜提取液的額外處理后,帶有熒光信號的斑馬魚SIV的生長呈現出較好的恢復狀態,并且黑蒜提取液的促SIV生成作用呈現出明顯的劑量依賴性,SIV條數隨著黑蒜提取液濃度升高而增加,當黑蒜提取液濃度增加至3.2 μL/mL時,PTK787對SIV的生成抑制作用幾乎消失,這提示黑蒜可促進斑馬魚SIV的再生,也說明黑蒜提取液的促心血管生成作用廣泛存在于斑馬魚心血管系統。

圖4 各組藥物處理后斑馬魚SIV生長情況的統計Fig.4 Statistics of angiogenesis of SIVs in zebrafish after drugs treatment注:各組斑馬魚胚胎SIV條數統計圖,*p<0.05對應于空白對照組與血管模型組,#p<0.05對應于給藥組(陽性對照組或者黑蒜提取液處理組)與血管模型組。

2.2 黑蒜提取液對人臍靜脈內皮細胞增殖的影響

內皮細胞增殖檢測實驗如圖5所示,內皮細胞貼壁生長,胞體為扁平多角形或梭形,呈鋪路石狀相互嵌合,邊界清晰。

圖5 黑蒜提取液對人臍靜脈內皮細胞增殖的影響Fig.5 Effects of black garlic extract on proliferation of HUVECs 注:A-E分別為人臍靜脈內皮細胞的典型生長圖,A為空白對照組,B為陽性對照組,C-E為黑蒜提取液處理組(0.2 μL/mL(圖C)、1.0 μL/mL(圖D)、5.0 μL/mL(圖E))。

如圖6所示,相較于空白對照組,陽性對照組中丹紅注射液可顯著促進臍靜脈內皮細胞的生長(p<0.05),增加內皮細胞數目及其活性。較低濃度的黑蒜提取液(0.2 μL/mL)作用下,內皮細胞活性稍有下降,但與空白對照組無顯著性差異(p>0.05);中濃度的黑蒜提取液(1.0 μL/mL)作用下,內皮細胞活性有增強趨勢,但與空白對照組仍無顯著性差異(p>0.05);高濃度的黑蒜提取液(5.0 μL/mL)作用下,內皮細胞活性顯著高于空白對照組(其吸光度呈現出明顯的統計學差異,p<0.05)。且隨著黑蒜提取液使用濃度的提高,內皮細胞密度變大,活性增強,呈現出一定的劑量依賴性,這提示黑蒜對人臍靜脈內皮細胞的生長起到一定的促進作用。

圖6 黑蒜提取液對人臍靜脈內皮細胞增殖影響的統計Fig.6 Statistics of proliferation of HUVECs by black garlic extract注:經CCK-8試劑盒處理后測得的各組細胞溶液的吸光度統計圖。*p<0.05對應于陽性對照組與空白對照組,#p<0.05對應于黑蒜提取液處理組與空白對照組。

3 討論與結論

已有的研究顯示,黑蒜提取液可能通過減輕大鼠中性粒細胞浸潤、抑制脂質過氧化等機制,進而增加心肌缺血再灌注的保護作用[21];而Cheol等[22]研究發現黑蒜己烷提取物能顯著降低白血病細胞U937的細胞增殖,促進心血管系統的發揮正常的生理作用。大蒜類食品對心腦血管疾病等有較好的防治功能[23]已是學術界普遍認可的觀點,而黑蒜在替代大蒜作為藥食兼用的保健品中所擁有的多項優勢[3-6],使得研究黑蒜的心血管保護作用變得愈發重要。本實驗通過體內和體外實驗對黑蒜的促進血管生成作用進行研究,根據熒光標記的flk-1:GFP系轉基因斑馬魚血管生成實驗,PTK787可以顯著減少ISV的數目(p<0.05),導致ISV發育畸形,而黑蒜提取液可顯著改善該模型中ISV發育畸形的問題,且帶有熒光信號的ISV條數隨著黑蒜提取液濃度升高而增加,表明黑蒜提取液的促血管再生作用呈現出顯著的劑量依賴性。同樣,黑蒜提取液在促進SIV的生成中呈現出明顯的濃度依賴性,這表明黑蒜的促心血管生成作用廣泛存在于斑馬魚心血管系統。另一方面,體外實驗中,利用人臍靜脈內皮細胞研究黑蒜提取液的促血管生成作用,黑蒜提取液可顯著增加細胞密度(p<0.05),增強細胞活性,并呈現出一定的劑量依賴性,這提示黑蒜或許同樣促進包括人在內的哺乳動物血管的生成作用,再次為黑蒜促進血管生成提供了科學依據。而以血管內皮生長因子Ⅱ型受體Flk-1標記血管的flk-1:GFP系轉基因斑馬魚則提示黑蒜促進血管新生的機制可能與血管內皮生長因子及其受體有關。鑒于此,黑蒜作為新興產品,有待開發成為一類防治心血管系統疾病的藥食兼備的保健品。