五味子酸性多糖分級產物對小鼠急性酒精性肝損傷的改善作用

潘 炎,陶 雪,梁 爽,苑榮爽,李 賀,孫靖輝,陳建光,王春梅

(北華大學藥學院藥理教研室,吉林吉林 132013)

五味子(Schisandrachinensis)為木蘭科植物,其干燥成熟的果實是著名滋補性中藥,具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心等功效。我國五味子南北均有分布,即南五味子(華中五味子)和北五味子(五味子)[1-4]。其中北五味子色黑,有效成分含量豐富,是長白山道地藥材。五味子作為我國傳統保肝藥物,臨床常用于復方護肝制劑中,但有關五味子保肝作用的物質基礎一直沒有明確定論[5-8]。

五味子的主要活性成分有木脂素類、多糖及揮發油等。其中多糖成分大約占五味子的10%左右[9-11]。近年的研究表明五味子多糖具有抗氧化、鎮咳、護肝、抗炎等多種功效,且安全性較好,日益受到業界的關注[12-15]。然而由于多糖的結構復雜,多數研究都以五味子粗多糖為研究對象,課題組的研究也表明五味子粗多糖對CCl4、高脂飲食等誘導的肝損傷具有良好的保護作用[16-17],然而有關其進一步的分級產物是否具有護肝作用尚未見報道。

本研究采用現代工藝分離純化五味子酸性多糖分級產物,建立小鼠急性酒精性肝損傷模型,觀察五味子酸性多糖分級產物對急性酒精性肝損傷的保護作用,為其進一步開發利用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

五味子 吉林省集安五味子種植基地;葡萄糖標準品 北京化學試劑公司;苯酚 天津天泰精細化學品有限公司;濃硫酸、乙醇 北京化工廠;間羥基聯苯、氨基磺酸 Sigma;雄性ICR小鼠 50只,體重19～21 g,由長春億斯實驗動物技術有限公司提供,動物檢測合格證號:SCXK(吉)2016-0003;超氧化物歧化酶(SOD)測試試劑盒、甘油三酯(TG)測試試劑盒、丙二醛(MDA)測試試劑盒、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)測試試劑盒、血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)測試試劑盒 南京建成生物工程公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒 碧云天生物技術公司;DEAE-纖維素 上海恒信化學試劑有限公司。

Infinite M200TECAN型酶標儀 瑞士TECAN集團公司;S10型手提式高速分散器 寧波新生生物科技股份有限公司;5418R型小型臺式冷凍離心機 德國Eppendorf公司;721B型分光光度計 上海第三分析儀器廠;DP71型光學顯微鏡 日本Olympus公司;Thermo ODS HYPERSIL高效液相色譜柱 日本島津;Shimadzu HPLC系統 日本Shimadzu公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 五味子酸性多糖的提取、分離與純化 經預實驗確定五味子多糖的最佳提取工藝條件,具體為五味子果實1.0 kg加入10倍蒸餾水浸泡24 h,經100 ℃熱水煮提2次(3 h+2 h),將提取液經80 ℃濃縮至2 L,離心(4500 r/min,15 min),棄去沉淀。向上清液加入95%乙醇,乙醇終濃度為75%(用酒精計測定),沉淀24 h,離心(4500 r/min,15 min),收集沉淀。將沉淀依次用95%乙醇和無水乙醇洗滌,水浴蒸干,得粉末狀五味子多糖85.5 g,得率為8.55%(多糖得率(%)=多糖質量/五味子樣品質量×100)。制備0.5%的多糖水溶液,上平衡好的DEAE-纖維素離子交換層析柱(20 mL,Cl-型),首先用蒸餾水洗脫,去除中性多糖,再用0.1、0.2、0.3和0.5 mol/L NaCl溶液進行線性梯度洗脫,流速1 mL/min,分別收集洗脫液,加熱濃縮后干燥(80 ℃),得五味子酸性多糖,得率約為2.8%。取5 mg五味子酸性糖,溶于1 mL蒸餾水中,再次用0.1、0.2、0.3和0.5 mol/L NaCl水溶液進行線性梯度洗脫,分別收集洗脫液,通過離子交換柱層析,可制備出五味子酸性糖分級產物。酸性糖分級產物得率(%)=分級產物質量/五味子酸性多糖樣品質量×100。

1.2.2 五味子酸性多糖的化學組成分析 采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[18],間羥基聯苯法測定糖醛酸含量[19],考馬斯亮藍法測定蛋白質含量[20],采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化[21]和高效液相色譜法(洗脫流速為1.0 mL/min,色譜柱為Thermo ODS HYPERSIL色譜柱4.6 mm×150 mm,洗脫液為81.8%的PBS溶液0.1 mol/L,pH7.0和18.2%的乙腈v/v,檢測溫度為35 ℃,檢測波長為245 nm)分析五味子多糖各級分的單糖組成。

1.2.3 酒精誘導急性肝損傷動物模型的建立及處理 將50只小鼠按體重隨機分組,分別為正常對照組、模型對照組、SCAP-2各劑量組(5、10、20 mg/kg·bw)每組10只。常規飼料喂養,自由飲水。SCAP-2各劑量組給予SCAP-2進行灌胃,正常對照組和模型組給予同體積蒸餾水灌胃,每日一次,連續15 d。末次給藥1 h后,模型組及SCAP-2各劑量組小鼠給予灌胃50%乙醇(12 mL/kg·bw),正常對照組小鼠給予同體積生理鹽水灌胃,禁食不禁水。16 h后,各組小鼠摘取眼球取血,3500 r/min,4 ℃離心,分離血清,裝入1.5 mL離心管內,-80 ℃凍存。斷髓處死小鼠,迅速剖腹取出肝臟于冷的生理鹽水中,濾紙吸干。觀察整體形態以及表面光澤,取每只小鼠相同部位的肝小葉組織,分為兩份,一份置于10%中性福爾馬林溶液中固定待用,一份制備勻漿以用于肝組織相關指標檢測。

1.2.4 ALT和AST水平的檢測 采用酶法測定血清中AST和ALT水平,具體方法參照試劑盒說明書。

1.2.5 MDA、TG含量和SOD活性的檢測 剪取一定量的肝組織加入9倍量的生理鹽水,在冰水浴中用勻漿機制成組織勻漿,2500 r/min離心15 min,取上清液,-80 ℃凍存。分別采用TBA法和WST-1法測定肝組織和血清中MDA含量及SOD活性,采用GPO-PAP酶法測定肝組織中TG含量,BCA試劑盒檢測蛋白濃度,具體方法參照試劑盒說明書。

1.2.6 病理學檢查 剪下肝左葉置于10%福爾馬林溶液固定,石蠟包埋切片常規 HE 染色。在光鏡下觀察肝臟病理學變化。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 五味子酸性多糖的化學組成分析

經過離子交換柱層析進行洗脫分級制備得到五味子酸性糖SCAP-1、SCAP-2、SCAP-3和SCAP-4。如表1所示,五味子酸性多糖SCAP-2的得率和糖醛酸含量最高,所以后續的實驗選用SCAP-2級分。

表1 五味子酸性多糖的化學組成分析Table 1 Analysis of chemical composition of Schisandra chinensis acidic polysaccharides

2.2 SCAP-2對小鼠血清中ALT和AST水平的影響

AST和ALT是肝細胞內的主要功能酶,是肝細胞損害的敏感性指標,故小鼠血中AST和ALT水平的高低可判斷其肝細胞損傷的程度[22]。由表2可知,與正常對照組比較,模型組小鼠血清AST和ALT水平均極顯著增高(p<0.01),說明小鼠一次性灌胃50%乙醇可引起肝細胞損傷;與模型組相比,不同劑量的SCAP-2可使小鼠血清中ALT和AST水平均有所下降,其中低劑量的SCAP-2對小鼠血清中ALT和AST水平的下降作用不顯著,中劑量的SCAP-2可顯著降低小鼠血清中的ALT水平(p<0.05),但對AST水平的降低效果不顯著,而高劑量的SCAP-2可顯著降低小鼠血清中的ALT和AST水平(p<0.05)。由此可知,適當劑量的SCAP-2對酒精誘導的小鼠肝損傷具有一定的保護作用。

表2 SCAP-2對小鼠血清中ALT和AST水平的影響(n=10)Table 2 Effects of SCAP-2 on ALT and AST levels in the serum of mice(n=10)

2.3 SCAP-2對小鼠血清中SOD活性和MDA含量的影響

酒精引起肝損傷的主要機制為氧化應激損傷。MDA是生物體內脂質過氧化反應的最終代謝產物,可破壞細胞膜結構,導致細胞腫脹壞死,其含量可以反映過氧化損傷和細胞受損的程度。而SOD是生物體內重要的抗氧化酶,能有效清除代謝過程中產生的氧自由基,減輕氧化應激損傷,測定其活性可間接反映機體的抗氧化能力[23]。由表3可知,與正常對照組比較,模型組小鼠血清中SOD活性顯著降低(p<0.05)、MDA含量顯著升高(p<0.05),表明酒精致肝損傷小鼠機體抗氧化能力降低,氧化應激增強;與模型組比較,除SCAP-2低劑量組外,SCAP-2的其他兩個劑量組均可顯著升高SOD含量(p<0.05),顯著降低MDA含量(p<0.05),其中,SCAP-2高劑量組對小鼠血清SOD水平的升高作用極顯著(p<0.01)。由此表明,SCAP-2可能通過提高機體抗氧化能力改善酒精誘導的小鼠肝損傷。

表3 SCAP-2對小鼠血清中MDA含量和SOD活性的影響(n=10)Table 3 Effects of SCAP-2 on MDA content and SOD activity in the serum of mice(n=10)

2.4 SCAP-2對小鼠肝組織中MDA、TG含量和SOD活性的影響

大量攝入酒精,不僅可以引起肝臟氧化應激損傷,還可以使三羧酸循環和脂肪酸氧化受阻從而影響脂肪代謝,致使甘油三酯(TG)在肝細胞內沉積,大量蓄積可能導致病變[24]。本研究進一步檢測了肝組織中MDA和TG含量和SOD活性。由表4可知,與正常對照組比較,模型組小鼠肝組織中MDA和TG含量顯著增高(p<0.05或p<0.01),SOD活性顯著降低(p<0.05),提示模型建立成功;與模型組比較,SCAP-2低、中劑量組可顯著升高小鼠肝組織的SOD水平(p<0.05或p<0.01),但對小鼠肝組織中MDA和TG含量影響不顯著;SCAP-2高劑量組可極顯著升高小鼠肝組織的SOD水平(p<0.01),降低TG含量(p<0.01),顯著降低小鼠肝組織中MDA含量(p<0.05)。由此可知,適量劑量的SCAP-2可以使小鼠肝臟的氧化應激狀況和脂肪代謝得以改善。

表4 SCAP-2對小鼠肝組織中MDA、TG含量和SOD活性的影響(n=10)Table 4 Effects of SCAP-2 on MDA and TG contents and SOD activity in the liver tissue of mice(n=10)

2.5 SCAP-2對小鼠肝組織病理形態的影響

由圖1可知,正常對照組小鼠的肝細胞排列整齊,大小正常,細胞核大而圓,核質均勻分布,無水腫、變性、壞死、無炎癥細胞浸潤等現象。模型組小鼠肝組織中肝索排列不規則,整個肝細胞胞漿疏松化,表明小鼠急性酒精性肝損傷模型建立成功。SCAP-2各劑量組小鼠肝細胞排列整齊,整個肝細胞胞漿疏松化明顯減輕,且以高劑量組明顯,表明SCAP-2可以改善酒精誘導的小鼠肝臟病理學變化。

3 討論與結論

多糖是五味子的主要活性成分之一,與木脂素類成分相比,具有含量高、毒性低等優點,極具開發價值。本研究采用柱層析法,經過離子交換柱層析進行洗脫分級制備得到五味子酸性多糖SCAP-1、SCAP-2、SCAP-3和SCAP-4。進一步,觀察了SCAP-2對酒精性肝損傷的影響,結果表明SCAP-2可降低酒精誘導肝損傷模型小鼠血清中AST和ALT水平,改善肝細胞病理形態學變化,對急性酒精性肝損傷具有一定的保護作用。

肝臟是機體乙醇代謝的主要場所,在乙醇脫氫酶作用下生成乙醛,進而轉化為乙酸,進入體循環。乙醇的大量脫氫氧化導致三羧酸循環障礙和脂肪酸氧化減弱而影響脂肪代謝,使TG在肝細胞內沉積,同時過量酒精攝入引起肝細胞發生脂質過氧化,并產生大量的氧自由基(ROS),過量的ROS造成氧化應激、最終促進脂質氧化過程。因此,氧化損傷是酒精誘導肝損傷的主要機制之一。研究報道五味子多糖不僅可以清除二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)、超氧陰離子自由基、羥自由基等,而且可以降低四氯化碳(CCl4)中毒小鼠肝組織丙二醛含量,提高SOD活性和GSH含量,體內體外均具有顯著的抗氧化作用[25-26]。本研究結果也顯示SCAP-2能夠降低小鼠血清和肝組織中MDA含量,增加SOD活性,提示SCAP-2對酒精性肝損傷的保護作用可能與其抗氧化作用有關。

綜上所述,五味子酸性多糖的分級產物SCAP-2能降低急性酒精性肝損傷小鼠的血清轉氨酶水平,改善肝臟病理學變化,對酒精誘導的急性肝損傷具有顯著的保護作用,且其作用機制可能與抗自由基脂質過氧化反應及改善肝臟脂質代謝有關,這些結果為五味子多糖的進一步開發利用提供了理論依據。