蔓菁對小鼠腸道菌群的影響

王文寧,張曉峰,韓 萍,*,于 斐,曹 陽

(1.鄭州大學公共衛生學院營養與食品衛生學教研室,河南鄭州 450001;2.鄭州大學公共衛生學院衛生化學教研室,河南鄭州 450001)

蔓菁(BrassicarapaL.),又名蕪菁,屬十字花科蕓薹屬蕓薹種蕪菁亞種,為兩年生草本植物。蔓菁適應性強,易于栽培,從東漢時期便在我國普遍種植[1],目前產地遍及西藏、新疆、晉南等地。蔓菁是我國常見的食用蔬菜之一,其肉質根既可食用[2],又可藥用,有藏族、維吾爾族、普米族藥用歷史[3]。

研究表明,蔓菁富含多糖、氨基酸、纖維素、黃酮等成分[1],其提取物具有多種生物學活性。王宇等[4]、楊永東[5]證實蔓菁多糖可減少血清和腦組織中丙二醛含量,提高超氧化物歧化酶的活性,具有抗缺氧活性。楊永東等[6]、馬合木提等[7]通過體外實驗發現,蔓菁子多糖可清除自由基達到抗氧化能力。安熙強等[8]發現蔓菁粉和蔓菁膏對小鼠輻射后損傷具有一定的防護、修復能力。陳湘宏等[9]發現蔓菁揮發油可顯著降低高脂高糖小鼠血糖。此外蔓菁提取物還具有提高免疫力[10]、抑制腫瘤生長[11]等活性。目前對于蔓菁對腸道功能及代謝的影響少有文獻報道。

本研究采用蔓菁粉飼喂小鼠,檢測小鼠糞樣中腸道菌群數量和短鏈脂肪酸(Short Chain Fatty Acids,SCFAs)的含量,探討蔓菁對腸道菌群的影響,為調節腸道功能新產品的開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蔓菁樣品 新鄉市鳳泉區,經鄭州大學藥學院的潘成學副教授鑒定為蔓菁塊根;SPF級近交系BalB/C雄性小鼠 48只,6～8 周,體重(20±2) g,河南省實驗動物中心(許可證號:SCXK(豫)2015-0004);基礎飼料 河南省實驗動物中心(許可證號:SCXK(豫)2015-0005);LBS瓊脂培養基、BBL瓊脂培養基、VRBDA培養基、腸球菌瓊脂培養基、TSC瓊脂培養基、卵黃乳液 BR級,青島海博生物技術有限公司;D-環絲氨酸、L-半胱氨酸 BR級,上海源葉生物科技有限公司。

觀察室 室溫18～22 ℃,相對濕度45%～55%,通風條件良好,環境相對安靜,鄭州大學公共衛生學院實驗動物觀察室(許可證號:SCXK(豫)2012-0007);DG250型厭氧工作站 英國DWS公司;PNP9082型恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司;7890B-5977A型氣質聯用儀 安捷倫科技有限公司;SW-CJ型超凈工作臺 蘇凈安泰空氣技術有限公司;HVE-50型高壓滅菌鍋 日本Hirayama公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 參照王宇等[5]的實驗方法并稍作改進。將實驗小鼠按體重隨機分為4 組,即對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組,每組12只,對照組飼喂標準基礎飼料,低、中、高劑量組分別飼喂不同劑量蔓菁粉(1、2、4 g/kg·BW·d),連續干預14 d。

1.2.2 復合飼料配制及干預方法 蔓菁塊根洗凈,去皮,切成1 mm薄片,50 ℃干燥12 h,粉碎,過60 目篩,放于干燥器備用。將蔓菁粉與基礎飼料以1∶2的比例混合,加適量去離子水,后壓縮成棒狀,制成復合飼料。干預組每日同一時間先給予復合飼料,吃完后再根據小鼠食量添加基礎飼料。每周稱量一次小鼠體重,根據體重調整干預劑量。

1.2.3 糞樣采集 分別在干預第0 d(飼喂前)、第7、14 d稱重并無菌收集約0.03 g新鮮糞樣于10 mL滅菌離心管中,加入5 mL滅菌稀釋液,振蕩混勻,制成樣本均質液,待測。

1.2.4 腸道菌群計數 參照《保健食品檢驗與評價技術規范》[12]。

1.2.4.1 滅菌稀釋液和培養基的配制 滅菌稀釋液:吐溫80 1 mL和酵母粉0.5 g溶解在1000 mL去離子水中,調節pH7.0～7.2,115 ℃高壓滅菌20 min,冷卻到50 ℃左右,無菌加入經濾膜除菌的0.5% L-半胱氨酸;LBS瓊脂培養基:取培養基84 g,加吐溫80 1 mL,冰乙酸1.3 mL,溶解在1000 mL去離子水中,調整pH6.0～6.5,118 ℃高壓滅菌15 min;BBL瓊脂培養基:取培養基70 g,加吐溫80 1 mL,溶解在1000 mL去離子水中,調整pH7.0,115 ℃高壓滅菌20 min;VRBDA培養基:取培養基39.5 g,溶解在1000 mL去離子水中,調整pH7.1,121 ℃高壓滅菌15 min;腸球菌瓊脂培養基:取培養基56.25 g,溶解在1000 mL去離子水中,調整pH8.0,121 ℃高壓滅菌15 min;TSC瓊脂培養基:取培養基47 g,溶解在1000 mL去離子水中,調整pH7.0～7.2,115 ℃高壓滅菌20 min,冷卻到50 ℃左右,無菌加入經濾膜除菌的0.5% D-環絲氨酸20 mL和50%卵黃溶液20 mL。

1.2.4.2 平板計數方法 采用平板計數法計數腸道菌群。10 倍梯度稀釋樣本均質液,接種于相應培養基上,雙歧桿菌采用BBL瓊脂培養基、產氣莢膜梭菌采用TSC瓊脂培養基厭氧培養,乳酸桿菌采用LBS瓊脂培養基、腸桿菌采用VRBDA培養基、腸球菌采用腸球菌瓊脂培養基正常培養,分別計數5種菌。

1.2.5 SCFAs含量的測定 取糞樣均質液2 mL于5 mL離心管中,4000 r/min離心10 min后,取上清1 mL于1.5 mL離心管中,加入0.75 mol/L鹽酸5 μL,振蕩混勻,靜置10 min,13000 r/min離心5 min,取上清1 mL過0.45 μm濾膜于進樣瓶中。樣品保存在4 ℃冰箱中(不超過3 d),待測。

采用氣相色譜-質譜聯用法檢測糞樣中乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸的含量。色譜條件為:色譜柱:Agilent DB-WAX石英毛細管柱(30 m×250 μm,0.25 μm);升溫程序:柱溫的起始溫度為40 ℃,維持1 min,以40 ℃/min的速度將溫度上升到60 ℃,再以10 ℃/min的速度將溫度上升到80 ℃,接著以10 ℃/min的速度將溫度上升到110 ℃,最后以40 ℃/min的速度將溫度上升到190 ℃,維持2 min;以氦氣為載氣,氣流流速為1 mL/min,不分流;進樣體積為0.5 μL,進樣口溫度為200 ℃。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 蔓菁對小鼠體重的影響

不同劑量組小鼠體重隨時間變化如表1所示。

表1 不同劑量組不同時間小鼠體重的變化(g,n=12)Table 1 Body weight of mice in different dose groups at different times

由表1可知,在干預第0、7、14 d,不同組組間小鼠體重變化差異不顯著,即攝入蔓菁對小鼠體重無不良影響。

2.2 蔓菁對小鼠腸道菌群數量的影響

2.2.1 蔓菁對小鼠糞樣中乳酸桿菌和雙歧桿菌數量的影響 不同劑量組不同時間小鼠糞樣中乳酸桿菌和雙歧桿菌的數量如表2所示。

由表2可知,與第0 d相比,飼喂第7 d,中劑量組小鼠糞樣中乳酸桿菌數量顯著增加(p<0.05),中、高劑量組小鼠糞樣中雙歧桿菌數量顯著增加(p<0.05),表明相對于乳酸桿菌,蔓菁對小鼠糞樣中雙歧桿菌數量影響較為明顯;飼喂第14 d,各劑量組小鼠糞樣中乳酸桿菌和雙歧桿菌數量均顯著增加(p<0.01),表明蔓菁可促進乳酸桿菌和雙歧桿菌的增殖。相同時間內,單一菌種不同劑量組比較,高劑量組乳酸桿菌數量增加最為明顯,中劑量組雙歧桿菌數量增加最為明顯,推測乳酸桿菌和雙歧桿菌的增殖與蔓菁的攝入量有關,可能存在一個最適范圍。單一菌種同劑量組不同時間比較,第14 d細菌數量增加最為明顯(p<0.01),表明蔓菁發揮效應需要一定時間累積。

表2 不同劑量組小鼠糞樣中乳酸桿菌和雙歧桿菌的數量(lg CFU/g,n=12)Table 2 The numbers of Lactobacillus and Bifidobacterium in the fecal samples of mice in different dose groups

2.2.2 蔓菁對小鼠糞樣中腸桿菌和腸球菌數量的影響 不同劑量組不同時間小鼠糞樣中腸桿菌和腸球菌的數量如表3所示。

表3 不同劑量組小鼠糞樣中腸桿菌和腸球菌的數量(lg CFU/g,n=12)Table 3 The numbers of Enterobacteriaceae and Enterococcus in the fecal samples of mice in different dose groups

由表3可知,與第0 d相比,飼喂第7 d,各劑量組小鼠糞樣中腸桿菌數量均無明顯變化(p>0.05),腸球菌數量均明顯減少,且中劑量組腸球菌數量減少最明顯,表明相對于腸桿菌,蔓菁對腸球菌的影響較為明顯;飼喂第14 d,各劑量組小鼠糞樣中腸桿菌數量均增加(p<0.05),腸球菌數量均明顯減少(p<0.05)。相同時間內,單一菌種不同劑量組比較,中劑量組腸桿菌和腸球菌變化最明顯(p<0.05),表明蔓菁可促進腸桿菌的增殖,抑制腸球菌的增殖,且蔓菁粉劑量為2 g/kg·BW·d時,作用效果最佳。

2.2.3 蔓菁對小鼠糞樣中產氣莢膜梭菌數量的影響 不同劑量組不同時間小鼠糞樣中產氣莢膜梭菌的數量如表4所示。

表4 不同劑量組小鼠糞樣中產氣莢膜梭菌的數量(lg CFU/g,n=12)Table 4 The number of Clostridium perfringens in the fecal samples of mice in different dose groups

由表4可知,與第0 d相比,飼喂第7 d,各劑量組小鼠糞樣中產氣莢膜梭菌數量無明顯變化(p>0.05);飼喂第14 d,各劑量組小鼠糞樣中產氣莢膜梭菌數量均明顯減少(p<0.05),表明蔓菁可有效抑制產氣莢膜梭菌的增殖,且發揮效應需要一定時間累積。與對照組相比,飼喂第14 d,各劑量組小鼠糞樣中產氣莢膜梭菌數量均明顯減少(p<0.05),且中劑量組減少最為明顯(p<0.05),表明蔓菁粉劑量為2 g/kg·BW·d時,作用效果最佳。

2.3 蔓菁對小鼠糞樣中SCFAs含量的影響

2.3.1 蔓菁對小鼠糞樣中乙酸、丙酸含量的影響 不同劑量組不同時間小鼠糞樣中乙酸、丙酸的含量如表5所示。

表5 不同劑量組小鼠糞樣中乙酸、丙酸的含量(mmol/100 g,n=12)Table 5 The composition of acetic acid,propionic acid in the fecal samples of mice in different dose groups

由表5可知,與第0 d相比,飼喂第7 d,各劑量組乙酸、丙酸含量明顯增加(p<0.05);與對照組相比,在第7 d時,中、高劑量組乙酸含量明顯增加(p<0.05),低劑量組乙酸含量無明顯變化(p>0.05),各劑量組丙酸含量無明顯變化(p>0.05),表明相對于丙酸,乙酸更易受蔓菁干預影響。飼喂第14 d,各劑量組乙酸、丙酸含量均明顯增加(p<0.05),單一酸不同劑量組比較,高劑量組增加最明顯。由此表明,蔓菁可促進乙酸和丙酸的生成,乙酸含量明顯高于丙酸含量,且在蔓菁粉劑量為4 g/kg·BW·d時,作用效果最佳。

2.3.2 蔓菁對小鼠糞樣中正丁酸、異丁酸含量的影響 不同劑量組不同時間小鼠糞樣中正丁酸、異丁酸的含量如表6所示。

表6 不同劑量組小鼠糞樣中正丁酸、異丁酸的含量(mmol/100 g,n=12)Table 6 The composition of n-butyric acid,isobutyric acid in the fecal samples of mice in different dose groups

由表6可知,與第0 d相比,飼喂第7 d,各劑量組正丁酸的含量均明顯增加(p<0.05),各劑量組異丁酸含量無明顯變化(p>0.05),表明相對于異丁酸,正丁酸更易受蔓菁干預影響;與對照組相比,飼喂第7 d時,低、高劑量組正丁酸含量明顯增加(p<0.05),中劑量組正丁酸含量無明顯變化(p>0.05),高劑量組異丁酸含量明顯增加(p<0.05),低、中劑量組異丁酸含量無明顯變化(p>0.05),表明正丁酸、異丁酸的產生受蔓菁干預劑量的影響。飼喂第14 d,各劑量組正丁酸、異丁酸含量均明顯增加(p<0.05),且高劑量組增加最明顯,表明蔓菁可促進丁酸的生成,且在蔓菁粉劑量為4 g/kg·BW·d時,作用效果最佳。單一酸同劑量組不同時間比較,第14 d丁酸含量增加最為明顯(p<0.05),表明蔓菁發揮效應需要一定時間累積。

3 討論

作為維持腸道穩定的重要因素,腸道菌群與機體健康之間的關系越來越得到人們的重視[13]。研究發現,腸道菌群的失調與肥胖、肝臟疾病、糖尿病、自身免疫性疾病等疾病密切相關[14-16],而腸道益生菌雙歧桿菌、乳酸桿菌的補充可緩解腸道紊亂[17-18],相對于藥物或生物制劑調節腸道菌群,飲食結構的改變和膳食營養成為人們關注的熱門[19]。本研究在小鼠日常飲食中添加1、2、4 g/kg·BW·d劑量的蔓菁粉,干預后發現,小鼠糞便中的乳酸桿菌和雙歧桿菌的數量顯著增加(p<0.05),腸球菌和產氣莢膜梭菌的數目明顯減少(p<0.05),與徐梓荷[20]研究瑪咖對腸道菌菌群的影響結果一致,滿足《保健食品檢驗與評價技術規范》中調節腸道菌群的要求[12]。蔓菁對腸球菌和產氣莢膜梭菌的抑制作用可能與腸道內益生菌的增殖有關,Alimolaei等[21]研究發現,腸道內某些益生菌或益生菌菌制劑可有效抑制產氣莢膜梭菌的增長,本實驗結果與其一致。

短鏈脂肪酸主要由結腸厭氧菌發酵未被消化的碳水化合物形成的,主要包括乙酸、丙酸、丁酸[22-23],具有促進能量代謝,減輕肥胖[24]、消除炎癥[25]、改善腸道功能、提高免疫力[26]等功能,短鏈脂肪酸含量的增加對機體健康具有重要促進作用,所以本研究探討了蔓菁對小鼠腸道內短鏈脂肪酸含量的影響。通過蔓菁粉飼喂小鼠發現,干預后小鼠糞樣中乙酸、丙酸、丁酸含量均顯著增加(p<0.05),推測可能與蔓菁促進腸道益生菌增殖,抑制腸道有害菌的增殖及腸道環境的改變有關,這與徐梓荷[20]研究瑪咖對腸道菌群調節,進而對短鏈脂肪酸含量產生的影響結果一致,具體機制還有待進一步研究。所以日常飲食中添加蔓菁可以有效促進腸道短鏈脂肪酸的產生,降低腸道pH,維持機體健康。

4 結論

蔓菁可促進腸道益生菌乳酸桿菌、雙歧桿菌和中性菌腸桿菌的增殖,中劑量(2 g/kg·BW·d)作用最為明顯,且腸桿菌數量增加幅度低于乳酸桿菌和雙歧桿菌增加幅度,并抑制中性菌腸球菌和致病菌產氣莢膜梭菌的增殖。蔓菁還可促進腸道內乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸的產生,提高短鏈脂肪酸總含量,且高劑量(4 g/kg·BW·d)作用最為明顯。