中國野生藍莓總花青素對氯化鎘誘導的慢性肝損傷的保護作用

岳 恒,許倩倩,景志行,蘇攀峰,許劍鋒,*,于曉巍

(1.上海海洋大學食品學院海洋生物制藥教研室,上海 201306;2.農業(yè)部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(上海),上海 201306;3.上海交通大學附屬上海市第六人民醫(yī)院東院骨科,上海 201306)

肝臟是腹腔內最大的實質性器官,擔負人體的重要生理功能。作為消化器官,肝臟對糖類、蛋白質、脂肪三大營養(yǎng)物質的合成、轉化和代謝具有重要作用,保障生命體的生存和發(fā)展。目前肝臟疾病成為威脅人類健康的常見疾病之一[1]。隨著工業(yè)的迅猛發(fā)展和經濟增長,有毒化學物質,包括重金屬和殺蟲劑廣泛應用于發(fā)展中國家,環(huán)境中的重金屬越來越多,對人類的健康和安全造成了極大的影響[2-3]。重金屬鎘可經消化道或呼吸道進入人體,對骨骼、腎、肝臟、生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等均可造成損傷,且在人體內的生物半衰期長達10～30年,可引起慢性毒作用[4]。研究[5-7]表明,慢性病(糖尿病、高血壓、代謝綜合癥、癌癥等)與體內的氧化應激平衡密切相關,而攝入一些抗氧化成分則有利于改善體內的氧化還原平衡。藍莓總花青素(blueberry anthocyanins,BA)是藍莓果實中天然含有的物質,具有抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性[8],但國內外對于藍莓總花青素的保肝、護肝效果的研究鮮有報道,可能與中國野生藍莓口感稍差有關[9]。

利用傳統(tǒng)解毒劑驅排體內蓄積的鎘雖能起到一定的解毒作用,但是對機體本身的副作用較大[10-11]。為了開發(fā)天然高效的解毒劑,本研究以CdCl2灌胃小鼠建立慢性肝損傷動物模型,肝臟Cd2+含量、總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽-S轉移酶(GST)含量、還原型谷胱甘肽(GSH)含量以及血清中谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)含量為指標,研究中國野生藍莓總花青素對慢性肝損傷的輔助治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中國野生藍莓 采摘于中國大興安嶺林區(qū);昆明種小鼠(SPF級,雄性) 50只,體重(18±2)g,許可證號:SCXK(滬)2012-0002,上海斯萊克實驗動物有限責任公司;XAD-7HP大孔樹脂 美國Sigma公司;總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒、谷胱甘肽-S轉移酶(GST)試劑盒、還原型谷胱甘肽(GSH)測定試劑盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;氯化鎘(CdCl2) 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;其他試劑均為分析純。

SB25-12D型超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;WFX-10型原子吸收分光光度計 北京第二光學儀器廠;6400型火焰光度計 上海分析儀器廠;UV-2450型紫外可見分光光度計 日本島津;CR-21G型高速冷凍離心機 日本Hitachi公司;AEROSET全自動生化分析儀 美國雅培制藥有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 中國野生藍莓總花青素的提取 純化總花青素由本實驗室改進Prior RL等[12]的方法自行提取,藍莓凍果粉碎后冷凍干燥成粉末狀,過60目篩,取200 g粉末,與甲醇∶水∶甲酸=85∶15∶0.5(體積比)的3000 mL混合溶液混勻,攪拌30 s,超聲功率500 W下,于40 ℃超聲5 min,在此過程中充分搖勻2次,使樣品重新混勻,靜置5 min后,攪拌30 s,靜置5 min。離心10 min(6000 r/min,4 ℃),收集上清液。殘渣中加入2000 mL甲醇∶水∶甲酸=85∶15∶0.5的混合溶液按上述方法繼續(xù)提取,重復提取5次左右,直至殘渣中顏色不再變化,合并所有上清液,離心10 min(8000 r/min,4 ℃),取上清液,40 ℃減壓蒸發(fā)除去甲醇,置于-20 ℃冰箱保存。將上述所得的提取液裝入XAD-7HP大孔樹脂柱中純化,體積比為1∶3。大孔樹脂采用濕法裝柱,先用 95% 乙醇洗脫 2～3 個BV,其次用蒸餾水洗至無醇味,最后用2～3倍體積 0.5%甲酸水溶液飽和吸附柱,上樣2 mL,充分吸附后開始洗脫,流速0.5 mL/min,先用超純水洗脫,去除多糖、蛋白等雜質,再用0.5%甲酸酸化的甲醇洗脫5 BV,回收洗脫得到的總花青素,40 ℃減壓蒸餾去除酸化甲醇,乙酸乙酯(1∶3=v∶v)室溫下萃取3次,每次30 min,最后減壓濃縮收集得總花青素,置于-20 ℃保存[13]。

1.2.2 中國野生藍莓總花青素含量的測定 采用pH示差法測定藍莓總花青素的含量(矢車菊-3-O-葡萄糖苷為對照),各取1 mL樣品分別加入4 mL pH4.5的醋酸鈉緩沖液(0.4 mol/L)和0.025 mol/L氯化鉀緩沖溶液(pH1.0),充分振蕩均勻,分別在波長520和700 nm下測定吸光值。重復3次,結果按照以下公式計算。

式中:C-中國野生藍莓中總花青素的含量,mg/100 g;A=(OD520-OD700)pH1.0-(OD520-OD700)pH4.5;ε-摩爾吸光系數(shù),按照矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的摩爾系數(shù)進行計算,是26900;MW-矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的摩爾質量,是449.2 g/mol;DF稀釋因子;1比色皿寬度(1 cm)。最后結果用100 g樣品中含有總花青素的量(mg)來表示。

1.2.3 動物分組與處理 小鼠適應性飼養(yǎng)一周,按體重均衡原則隨機分為5組,每組10只,分別為空白對照組(灌胃0.3 mL生理鹽水)、鎘損傷組(灌胃1.0 mg/kg/d的CdCl2+生理鹽水共0.3 mL)、藍莓總花青素低劑量組(BAL)、中劑量組(BAM)和高劑量組(BAH)(灌胃1.0 mg/kg/d的CdCl2,同時分別灌胃10.0、20.0、40.0 mg/kg/d的藍莓總花青素共0.3 mL)。每10 d固定時間對小鼠進行稱重,并按體重量進行精確喂飼,連續(xù)飼養(yǎng)90 d,實驗結束前24 h,所有小鼠禁食不禁水。

1.2.4 小鼠生活狀態(tài)觀察 觀察各組小鼠的生長情況,包括小鼠體重、身體外觀、進食量多少、排泄物量以及反應靈敏性等,并及時做好相關記錄。

1.2.5 小鼠肝臟系數(shù)的測定 解剖小鼠并取出肝臟,置于預冷過的生理鹽水中去除表面結締組織,經預冷過的生理鹽水漂洗3～4次后,用濾紙吸干表面水分并稱重,最后根據(jù)公式計算肝臟系數(shù):

1.2.6 肝臟組織中Cd2+含量測定

1.2.6.1 標準曲線的繪制 精確稱量CdCl2,用3 mol/L的硝酸完全溶解,配制含Cd2+為1 g/L的標準液備用。使用時逐級稀釋為50、10、5、1、0.5、0.1、0.01 μg/L的標準稀釋液液,4 ℃冷藏保存。開始測量時,按Cd2+濃度從小到大依次進樣,對不同濃度Cd2+溶液的吸光值進行檢測,最后記錄吸光值繪制標準曲線。

1.2.6.2 Cd2+含量的測定 5組小鼠肝組織樣本,分別稱取相同質量,置于坩堝內并標號,安置于馬弗爐中,500 ℃中灰化6 h;待自然冷卻后,用8 mL 3 mol/L的硝酸溶解殘留物直至完全溶解,過濾不溶物,于恒定4 ℃條件下保存。按照標準液中Cd2+濃度從小到大的順序進樣,得到標準曲線圖1。當R2>0.99 時,開始進行樣品測量,并記錄吸光度值,每個樣品測定三次,并對不同組小鼠肝臟Cd2+含量進行計算統(tǒng)計。

1.2.7 血清生化指標的檢測 眼眶取血約1 mL,置 EP 管中靜置 15 min,然后 4 ℃、3500 r/min 離心10 min,分離血清,-80 ℃保存?zhèn)溆谩２捎萌詣由治鰞x檢測谷草轉氨酶(AST)和谷丙轉氨酶(ALT)活性。

1.2.8 肝組織勻漿液中氧化損傷指標的測定 將取完血的小鼠斷頸處死,解剖分離肝臟,精確稱重,液氮冷凍后置 EP 管中,-80 ℃保存?zhèn)溆谩７Q取約0.2 g肝臟,加入9倍體積的生理鹽水充分研磨制成勻漿,于4 ℃、3000 r/min離心10 min,取上清液-80 ℃保存?zhèn)溆谩０丛噭┖兴霾襟E檢測樣本中總抗氧化能力(T-AOC)、抗氧化指標GSH、GST及脂質過氧化指標MDA。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 藍莓總花青素含量測定結果

以波長520 nm為最大吸收波長,并將花青素含量轉變成每100 g樣品含的花青素的量(mg)。測得該實驗藍莓中總花青素含量為(149.66±3.45) mg/100 g凍果。

2.2 小鼠生活狀態(tài)觀察

觀察各實驗組小鼠生長情況,發(fā)現(xiàn)空白對照組小鼠食欲旺盛,生長迅速,排泄物呈黑褐色規(guī)則米粒狀,毛皮光亮、柔順,腿部肌肉有力、富有彈性;眼睛明亮有神,反應敏捷;鎘損傷組小鼠嗜睡厭食,生長緩慢,排泄物稀少,呈灰色、灰褐色米粒或不規(guī)則形狀;毛皮暗啞泛黃;行動緩慢、反應遲鈍;藍莓總花青素3個劑量組,小鼠進食正常,排泄良好,毛皮柔順,眼睛靈活有神,反應機敏。

研究表明,CdCl2的攝入,對小鼠的食欲、生長、神經發(fā)育以及正常的生理活動造成嚴重影響,而通過飼喂藍莓花青素,小鼠的生長、生活情況得以明顯改善。

2.3 小鼠生長狀況

由表1可知,鎘損傷組與空白對照組比較,差異極顯著(p<0.01),說明鎘能夠對生長期小鼠的正常生長造成嚴重影響;與鎘損傷組相比,BA低、中、高劑量干預組小鼠每10 d體重增長差異極顯著(p<0.01),表明BA能夠在一定程度上改善鎘對小鼠所造成的生長緩慢,促進小鼠進食、健康生長。

表1 各組小鼠平均體重增長Table 1 Average body weight of mice in each group

2.4 小鼠肝臟系數(shù)

由表2可以看出,與鎘損傷組比較,空白對照組及BA低、中、高劑量干預組的肝臟重量及肝臟系數(shù)差異不顯著,3個劑量的BA組未對肝臟產生不良影響。

表2 各組小鼠肝臟濕重及肝臟系數(shù)Table 2 The wet weight of mice liver and liver coefficient in each group

2.5 肝臟組織中Cd2+含量

2.5.1 標準曲線圖 按照標準液中Cd2+濃度從小到大的順序進樣,得到標準曲線如圖1,其線性回歸方程為y=0.0003x+0.0012,R2=0.99993。

圖1 Cd2+標準溶液變化曲線Fig.1 Standard curve of the Cd2+ solution

2.5.2 Cd2+含量 由圖2可知,每天灌胃1.0 mg/kg的CdCl2,90 d后小鼠每單位肝組織中Cd2+含量達到(26.54±5.43)μg/g,與空白對照組差異極顯著(p<0.01),表示建模成功;與鎘損傷組相比,BA低、中、高劑量干預組小鼠每單位肝組織中Cd2+含量顯著降低(p<0.05),表明鎘在小鼠肝臟中代謝緩慢,不易排出,產生明顯的蓄積現(xiàn)象,而BA能夠很好的抑制鎘在肝臟處的蓄積,加速鎘排出肝細胞,從而減少游離Cd2+對機體的損傷。

圖2 不同組小鼠肝臟組織中Cd2+的含量Fig.2 Cd2+content in liver tissue of different groups of mice

2.6 血清生化指標

由圖3和圖4可知,與空白對照組相比,鎘損傷組AST、ALT指標均有極顯著差異(p<0.01),表明鎘對小鼠的肝臟造成了明顯的損傷。BA低、中、高劑量干預組AST、ALT指標與鎘損傷組差異極顯著(p<0.01),且與濃度呈負相關關系,表明BA能夠很好的抑制鎘引起的肝損傷致的AST、ALT升高,且存在一定的劑量效應關系。

圖3 不同組小鼠AST的活性Fig.3 AST activity of different groups of mice

圖4 不同組小鼠ALT的活性Fig.4 ALT activity of different groups of mice

2.7 肝組織勻漿液氧化損傷測定

從表3可知,與空白對照組相比,鎘損傷組T-AOC、GSH、GST、MDA指標均有極顯著差異(p<0.01);與鎘損傷組相比,BA高劑量干預組(40 mg/kg/d)的T-AOC、GSH、GST、MDA含量差異極顯著(p<0.01),BA中劑量干預組的T-AOC、GSH、GST含量顯著升高(p<0.05),但MDA含量的變化不顯著。BA低劑量干預組的T-AOC、GSH含量顯著升高(p<0.05),但GST與MDA含量的變化不顯著。整體來看,隨著BA濃度的升高,T-AOC、GSH、GST含量隨著升高,而MDA含量隨之降低。表明BA能夠在一定程度上抑制鎘損傷致小鼠肝臟組織氧化損傷,且抑制能力與BA的濃度相關。

表3 氧化損傷指標Table 3 Oxidative damage indicators

3 討論與結論

鎘致肝損傷的機理至今沒有明確的解釋,普遍的認為是鎘毒性與氧化損傷密切相關。例如急性鎘中毒情況下造成的氧化損傷與細胞內谷胱甘肽的減少有關[14],也有研究認為鎘染毒破壞了機體內部各個方面的動態(tài)平衡,進而造成對身體嚴重的影響[15-16]。鎘對機體的氧化損傷有很多種途徑,常規(guī)是兩種,分別是破壞體內自由基的平衡和抗氧化系統(tǒng)的功能[17]。

當肝實質細胞損傷,細胞膜結構和通透性的改變或破壞,使得肝細胞內的轉氨酶ALT、AST,進入血液中,因此血清轉氨酶ALT、AST 水平可以作為反映了肝臟組織細胞的損傷程度的敏感指標[18]。前者活性升高則提示肝細胞破壞、細胞膜通透性增強,后者活性增強提示線粒體損傷。兩者極易受到Cd2+的影響,其活性的變化可以反映肝細胞損害程度。本研究發(fā)現(xiàn),Cd2+的毒性效應會顯著增加小鼠血清 AST、ALT 的釋放,對肝臟造成炎癥損傷,而適當量的中國野生藍莓總花青素的干預能使血清 AST、ALT 釋放減少,減輕氯化鎘誘導的肝損傷的炎癥反應。實驗結果表明,1.0 mg/kg/d CdCl2飼喂小鼠90 d,小鼠日均體重增長極顯著下降(p<0.01),且血清指標AST、ALT極顯著升高(p<0.01),提示本實驗小鼠慢性肝損傷模型建立成功,與前人報道用CdCl2建立慢性肝損傷模型[19]相比,本實驗的染鎘周期增加到了90 d,大大增加了慢性肝損傷建模的周期,進一步研究了小鼠體重增長、肝臟組織中Cd2+的含量、血液、肝臟各項指標在這個周期中的變化。且本實驗鎘損傷組MDA含量極顯著高于空白對照組(p<0.01),說明連續(xù)90 d灌胃1.0 mg/kg/d的CdCl2可誘導肝臟細胞脂質過氧化損傷明顯增強,與以往的報道一致[20]。

在肝損傷的防治方面,與自由基密切相關的物質以及外源性抗氧化劑起著重要的作用[21-22]。機體內過量游離自由基會導致蛋白質、脂肪和核酸的氧化損傷,心臟病、關節(jié)炎、老年癡呆、癌癥等都與體內氧化與抗氧化體系失衡有一定關系[23]。人體內存在天然的抗氧化系統(tǒng),而外源的重金屬離子會破壞機體的氧化系統(tǒng)的平衡,從而導致機體氧化應激損傷[23]。大量研究表明,鎘通過影響肝臟細胞中相關抗氧化酶的活性,從而影響肝臟細胞中自由基的清除,肝臟細胞中游離的自由基作用于多不飽和脂肪酸生成MDA,加重脂質過氧化損傷,從而造成小鼠的肝臟損傷[25-27]。Cd2+體內的長期累積會導致機體氧化、抗氧化系統(tǒng)失衡,導致脂質過氧化終產物MDA增多,MDA是脂質過氧化損傷的主要降解產物,因此測定MDA這個指標能夠反映小鼠肝臟細胞脂質過氧化損傷的情況,而 T-AOC、GSH和 GST 作為抗氧化酶系統(tǒng)中的重要組成部分,能有效反映體內抗氧化系統(tǒng)的狀態(tài)。本文中BA各劑量干預組MDA指標均與鎘損傷存在差異,且與濃度呈負相關關系,表明藍莓花青素對小鼠肝臟氧化損傷有一定的保護作用,本結果與鄒志輝等[20]報道的葡萄籽原花青素對鎘致肝損傷保護作用的研究結果一致。藍莓總花青素可能通過大量清除肝臟細胞中自由基,從而改善肝臟細胞過氧化損傷,增強肝臟細胞中相應抗氧化酶的活性,從而提高肝臟細胞抗氧化能力,達到有效的保肝效果,但還需進一步深入研究證實。

本研究填補了中國野生藍莓總花青素在治療重金屬致慢性肝損傷方面研究的空白,為其開發(fā)成新型天然的解毒劑提供了重要依據(jù),但是目前國內對中國野生藍莓總花青素保肝效果的研究報道較少,因此需要對其作用機制展開進一步的研究。