翅果油聯合有氧運動對高脂飲食小鼠血脂代謝紊亂及肝臟脂質積累的改善作用

杜 杰

(山西大學體育學院,山西太原 030006)

近年來,隨著經濟的發展和人們生活水平的提高,高脂肪食物越來越多地出現在人們的餐桌上,造成人體脂肪攝入過量。大量研究表明,高脂肪飲食可誘發機體出現高血脂癥狀,而血脂紊亂是高血壓、動脈粥樣硬化、冠心病等心血管疾病發生的重要誘因[1-2]。不僅如此,血液中脂質物質含量升高也會導致肝臟脂質代謝紊亂,過量的脂肪積累在肝臟中引起肝臟組織變性,如不加以控制會進一步發展成肝臟疾病[3-4]。因此,調節機體脂質代謝平衡具有十分重要的意義。

國際上推薦預防脂質代謝紊亂及相關疾病的方法為生活方式的改變(如飲食習慣,作息習慣,規律運動等)[4,18],其中,中強度有氧運動是公認的調節脂代謝紊亂的有效手段之一[10]。然而人們往往苦于找不到合適的食物以及運動方案,從而達不到預期效果;或是一味地注重飲食忽略運動的重要性,形成多坐少動的生活方式。翅果油是翅果油樹種仁經過加工制成的淡黃色透明油狀液體,為第四紀冰川作用后殘遺下來的資源,富含不飽和脂肪酸、維生素E及植物甾醇等營養成分[5],具有降血脂、抗氧化、預防心血管疾病等功效[7-9],已經被我國批準為新資源食品[6]。目前有關膳食翅果油聯合中強度有氧運動改善高脂飲食引發的脂代謝紊亂及脂質積累方面的研究還未見報道。

本實驗對C57BL/6小鼠給以高脂飲食誘導血脂升高及肝臟脂肪變性,考察翅果油聯合有氧運動對高脂飲食誘導的血脂代謝紊亂和肝臟脂肪積累的改善作用,為飲食與運動相結合改善高脂飲食誘發的相關疾病的研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

翅果油 超臨界二氧化碳萃取所得,山西琪爾康翅果生物制品有限公司;雄性C57BL/6小鼠 SPF級,40只,4周齡,平均體重為(15.32+1.58) g,南京君科生物工程有限公司(許可證號為 SCXK(蘇)2016-0010)。小鼠分籠飼養,給以12 h光照,12 h黑暗,室內溫度為20～26 ℃,濕度為40%～60%;普通動物飼料 山西省醫科大學動物實驗中心;動物45% kcal高脂飼料(配方:酪蛋白23.30%,胱氨0.35%,玉米淀粉8.50%,麥芽糊精11.65%,蔗糖20.14%,纖維素5.83%,豆油2.91%,豬油20.68%,復合礦物質1.17%,磷酸氫鈣1.51%,碳酸鈣0.64%,檸檬酸鉀1.92%,復合維生素1.17%酒石酸氫膽堿0.23%) 北京科澳協力飼料有限公司;總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(LDL-C)酶學試劑盒 南京建成生物科技有限公司。

ZS-PT型動物實驗跑臺 北京眾實迪;KDC-140HR型高速冷凍離心機 中科中佳科學儀器有限公司;DW-86L959型超低溫冰箱 海爾生物醫療;Spectra Max190型酶標儀 美國分子儀器;JXFSTPRP-I-02型組織勻漿儀 上海凈信實業發展有限公司;Leica Rm2235型組織切片機 德國萊卡;BME500型生物顯微鏡 歐普林光電設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物飼養及分組 小鼠適應喂養1周后,隨機分為正常對照組(NC)、高脂飲食組(HF)、高脂飲食+翅果油灌胃組(HS)、高脂飲食+有氧運動組(HE)、高脂飲食+翅果油+有氧運動組(SE),每組8只,共喂養8周。正常組飼喂普通飼料,高脂飲食組飼喂高脂飼料,HS組在飼喂高脂飼料的同時每天早8點灌胃0.5 mg/g體重的翅果油,HE組在飼喂高脂飼料的同時每天上午10:00進行60 min中等強度有氧運動(按照Fernando等[11]方案,以10 m/min適應性跑步1周后,以12 m/min恒速跑步60 min),SE組在飼喂高脂飼料的同時每天灌胃翅果油及進行有氧運動。喂養期間,小鼠自由飲水,每3 d更換一次墊料,每周稱一次體重。

1.2.2 取材 小鼠喂養結束,禁食不禁水12 h,采用2%戊巴比妥鈉溶液麻醉,摘眼球取血,于3500 r/min,4 ℃離心20 min,分離血清,轉移到EP管中置于-20 ℃保存備用;小心摘取動物肝臟,用生理鹽水清洗,吸水紙吸取表面水分后稱重,并將動物肝臟一分為二,一部分迅速置于液氮中冷凍,用于檢測肝臟中TC、TG含量,一部分置于10%甲醛溶液中固定,用于肝組織形態觀察實驗。

1.2.3 血清指標檢測 小鼠血清脂質指標TC、TG、LDL-C和HDL-C含量按照酶聯免疫試劑盒說明書的操作進行檢測,并按照以下公式計算動脈粥樣硬化指數(AI)。

其中,CTC為血清TC濃度,mmol/L;CHDL-C為血清HDL-C濃度,mmol/L。

1.2.4 肝組織指標檢測 取0.1 g冷凍肝臟,切碎,于勻漿機中低溫勻漿,3500 r/min,4 ℃離心20 min,收集上清液,按照酶學試劑盒說明書測定肝臟組織TC和TG含量。

1.2.5 肝臟組織形態學檢測 取一小塊固定好的肝臟組織,按照以下步驟進行蘇木精和伊紅(H&E)染色。

脫水透明:肝臟組織分別置于不同濃度的酒精溶液中進行梯度脫水,再采用二甲苯透明處理45 min兩次;

包埋修快:透明處理的肝組織置于包埋盒中進行石蠟包埋,凝固后修塊;

制片:將修好的組織蠟塊置于組織切片機上切成6 μm的薄片,38 ℃水浴鍋中展開,貼于粘附載玻片上50 ℃烘干;

脫蠟:將制好的片依次在二甲苯中脫蠟20 min,梯度酒精浸泡5 min,蒸餾水浸泡5 min;

染色封片:蘇木精染色7 min,伊紅染色30 s,0.01%鹽酸酒精分色30 s,45 ℃水浴反藍 5 min,二甲苯浸泡兩次,每次5 min,中性樹脂封片；

組織觀察:將制好的切片置于光學顯微鏡下觀察肝臟組織病理形態并拍照。根據Kleiner等[12]方法對肝臟脂肪變性進行評分，肝臟脂肪變性評分如下:肝臟脂肪變性程度<5%,計0分;5%≤肝臟脂肪變性程度在≤33%,計1分;34%≤肝臟脂肪變性程度在≤66%,計2分;肝臟脂肪變性程度>66%,計3分。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 翅果油聯合有氧運動對高脂飲食小鼠體重的影響

各組小鼠在實驗期間體重的變化情況如圖1所,由結果可以看出,各組小鼠起始體重不具有顯著性差異(p>0.05)。經過8周的喂養,HF組小鼠體重顯著高于NC組(p<0.05);當實驗小鼠給予翅果油干預后,相比高脂飲食組(HF),HS組小鼠體重顯著降低10.64%(p<0.05),但仍與NC組體重具有顯著性的差異(p<0.05);經過有氧運動和翅果油聯合有氧運動的干預后,與HF組相比,HE和SE組小鼠體重分別降低18.73%和16.10%(p<0.05),基本達到正常喂養水平。

圖1 小鼠體重增長曲線Fig.1 Body weight gain curve of mice

2.2 翅果油聯合有氧運動對高脂飲食小鼠血清脂質指標的影響

各組小鼠在實驗期間血清TG、TC、LDL-C和HDL-C的變化如圖2所示,由結果可以看出,經過8周的喂養,相比NC組,高脂飲食組小鼠的血清TG、TC、LDL-C分別顯著升高了68.47%、92.89%、332%(p<0.05),血清HDL-C水平下降了24.88%,說明高脂飲食可以誘發機體脂質代謝紊亂,出現高血脂癥狀。經翅果油、有氧運動及聯合干預后,相比高脂飲食組(HF),HS、HE和SE組小鼠血脂TG、TC和LDL-C水平發生不同程度的降低(p<0.05),其中HS、HE和SE三組小鼠血清TG與NC組不具有顯著性差異(p>0.05),HE和SE小鼠血清TC也能降低到正常水平(p>0.05),SE組還能將LDL-C水平降低到正常水平(p>0.05),說明翅果油、有氧運動及聯合干預均能在一定程度上有效降低高脂飲食引起的血脂升高,改善血脂代謝紊亂,且聯合干預效果優于單獨干預。

圖2 翅果油聯合有氧運動對高脂飲食小鼠血脂及AI值的影響Fig.2 Effects of samara oil and aerobic exercise on serum lipids and AI of high-fat diet mice注:小寫字母不同表示組間差異顯著(p<0.05);圖3，圖5同。

高血脂是引起動脈粥樣硬化的危險因素,一般使用AI值評價引起動脈粥樣硬化的風險,由圖2可以看出,經過高脂飲食后,HF組小鼠相比NC組AI值顯著升高了4.22倍(p<0.05),而經過翅果油、有氧運動及聯合干預后,AI值分別顯著下降了27.30%、57.05%、65.41%(p<0.05),說明這3種干預均能在一定程度上降低由高脂飲食誘發的動脈粥樣硬化的風險,且聯合干預效果更好。

2.3 翅果油聯合有氧運動對高脂飲食小鼠肝臟指數的影響

肝臟是脂質代謝的主要器官,機體一旦出現脂代謝紊亂就會對肝臟產生一定的危害,其最直觀的指標就是肝臟指數。由表1的結果可以看出,相比正常飲食的小鼠,HF組小鼠在經過8周的高脂喂養后,肝指數顯著升高(p<0.05),說明高脂飲食能誘導肝臟發生一定的病變,可能出現肝臟腫大,充血,炎癥,增生等癥狀[11]。經過翅果油、有氧運動和聯合干預后,各組小鼠肝重和肝指數相比HF組均顯著下降(p<0.05),并且數值與NC組不具有顯著性差異(p>0.05),說明三種干預均有利于改善高脂引發的肝臟損害。

表1 翅果油聯合有氧運動對小鼠肝重和肝臟指數的影響Table 1 Effects of samara oil and aerobic exercise on liver weight and liver index of high-fat diet mice

2.4 翅果油聯合有氧運動對高脂飲食小鼠肝臟脂質指標的影響

各組小鼠在實驗期間肝臟TG和TC的變化如圖3所示,由結果可以看出,經過8周的喂養,HF組小鼠肝臟TG和TC水平相比NC組顯著升高了101.19%、89.75%(p>0.05),說明高脂飲食可能誘導肝臟脂質的積累。經翅果油、有氧運動及聯合干預后,相比高脂飲食組,HS、HE和SE組小鼠肝臟TG和TC水平顯著降低(p<0.05),且HE和SE組小鼠TG和TC含量與正常飲食組無顯著差異(p>0.05),說明翅果油、有氧運動及聯合干預對高脂飲食誘導的肝臟脂質積累具有一定的改善作用,從改善程度上看,聯合干預效果優于單獨干預。

圖3 翅果油聯合有氧運動對高脂飲食小鼠肝臟TC和TG的影響Fig.3 Effects of samara oil and aerobic exercise on hepatic TC and TG of high-fat diet mice

2.5 翅果油聯合有氧運動對小鼠肝臟組織的影響

各組小鼠肝臟組織石蠟切片H&E染色及肝臟脂肪變性得分如圖4、圖5所示,由結果可以看出,正常喂養組小鼠肝臟細胞處于正常形態,肝小葉結構清晰,肝板分界明顯,大致呈放射狀,肝板之間清晰可見肝血竇,肝細胞大小正常,核大而圓,居于肝細胞中央。高脂飲食組小鼠肝臟組織發生一定程度的脂肪變性,肝小葉不清晰,肝板分界不明顯,排列紊亂,肝血竇受壓變窄,肝細胞體積增大,大小不一,細胞核偏離中央,胞漿內出現大量脂肪空泡。經翅果油干預后,肝組織脂肪變性得到明顯的改善,胞漿內的脂肪空泡明顯變小、減少,一部分肝細胞形態恢復到正常形態;經過有氧運動干預后,肝組織變性得到一定程度的恢復,肝板分界明顯,肝血竇清晰,部分肝細胞形態恢復正常,胞漿內有少量小的脂肪空泡。類似地,經翅果油和有氧運動聯合干預后,肝組織變性得到很大程度的恢復,肝板分界明顯,排列整齊,肝血竇清晰可見,大部分肝細胞恢復到正常狀態,細胞核處于細胞中央,未見脂肪空泡。

圖4 肝臟組織H&E染色(200×)Fig.4 H&E staining of liver tissues(200×)

圖5 肝臟脂肪變性評價Fig.5 Hepatic steatosis grade

3 討論

大量研究發現,過量膳食高脂食物可引起機體脂肪代謝紊亂,導致機體血脂異常,長期膳食高脂會增加動脈粥樣硬化及非酒精性脂肪肝發生的風險[13-14]。本實驗以高脂飼料飼喂C57BL/6小鼠8周后,小鼠體重、血脂水平、肝臟系數、肝臟脂質水平都發生了顯著的升高(p<0.05),并出現了一定程度的肝臟脂肪變性。

據文獻報道,翅果油富含90%以上不飽和脂肪酸,植物甾醇,維生素E等,且居民熬油食用歷史悠久,具有很好的調節脂代謝平衡、抗氧化、預防心血管疾病等功效[5-9]。陳雨娜[7]比較了膳食翅果油和花生油對正常飲食昆明小鼠抗氧化能力和脂質代謝的影響,結果表明翅果油能有效提高抗氧化能力以及降低血清TC、TG和LDL-C水平。類似地,黃玲等[8]比較了膳食色拉油、VE和翅果油對老齡鼠血清和肝臟抗氧化能力,結果發現相比膳食色拉油,VE和翅果油能顯著降低血清和肝臟MDA含量,增加GSH-Px酶活性,說明翅果油具有很好的抗氧化能力。白誼涵等[9]考察了服用翅果油對高血脂患者血脂TC、TG、LDL-C和HDL-C的影響,發現相比未服用的患者,服用翅果油能有效降低高血脂患者血脂水平。從已有報道可以看出,翅果油調節脂質代謝的能力已被證實,然而研究尚處于起步階段,且還未見有翅果油對高脂飲食誘發的脂代謝紊亂和脂質積累方面的研究。此外國內外公認的改善機體代謝平衡的方法是中強度有規律的有氧運動[10],有氧運動通過增加能量消耗,改善骨骼脂質氧化,減少體內過多脂肪堆積,從而有效改善血液脂質水平紊亂[15-16]。研究發現,有氧運動在消耗多余能量時,可能通過上調β-氧化產生乙酰輔酶A,上調偶聯蛋白-1和過氧化物酶增殖物激活的受體C,導致脂肪組織的脂解,從而減輕體內脂肪的堆積,降低體重及改善機體代謝平衡[17-18]。本實驗在喂食高脂飼料的同時給以翅果油、有氧運動及翅果油和有氧運動聯合干預,結果發現3種干預方法均能顯著降低高脂飲食引起的體重增加、血脂水平升高及動脈粥樣硬化發生的風險,其中效果最突出的是翅果油和有氧運動聯合干預,不僅能使體重降低到正常水平,還可使血清TC、TG和LDL-C降低到正常水平,其次是有氧運動,翅果油干預,說明通過飲食的改變結合有規律的運動能夠有效改善高脂膳食引起的脂代謝紊亂。

過多脂肪的攝入加大了肝臟組織對脂質的攝取,破壞肝臟脂代謝平衡,多余的脂質以脂滴的形式在肝臟堆積,引起肝組織脂肪變性[19]。從本實驗的結果可以看出,高脂飲食組肝臟TG、TC含量顯著升高,肝組織H&E染色出現明顯的脂肪變性。從脂肪的消化、吸收、利用的途徑可以發現,血液中脂質水平的升高致使肝臟、脂肪組織對脂質的攝入增加,同時脂肪組織過多積累脂肪后還會向血液中釋放游離脂肪酸,導致血液中游離脂肪酸的水平加大[20];脂肪酸通過門靜脈直接進入肝臟進行合成、轉運及氧化利用[21];并且過多脂肪的攝入上調SREBP-1c的表達,促進脂肪合成,阻礙脂肪氧化途徑,從而導致肝臟脂質的堆積[22]。研究發現,中強度有氧運動可通過調節肝臟脂肪合成和脂肪酸β-氧化來改善肝臟脂質代謝[10]。本研究也發現翅果油、有氧運動和聯合干預后肝臟脂質水平及脂質堆積得到了明顯的改善,其中翅果油和有氧運動聯合干預的作用效果更為明顯,其次是有氧運動證實了運動在改善肝臟脂質代謝中所起到的重要作用,以及運動和飲食相結合所起到的疊加效應,然而聯合干預是如何改善高脂誘發的血脂代謝紊亂和脂質積累的機制還有待進一步研究。

4 結論

翅果油、有氧運動和翅果油聯合有氧運動干預能夠顯著降低高脂飲食引起的體重增加(p<0.05),血清TG、TC、LDL-C水平的升高(p<0.05),以及降低肝臟TG、TC的堆積(p<0.05),減輕肝臟脂肪變性程度,其中翅果油聯合有氧運動干預效果優于翅果油、有氧運動單獨干預效果,說明通過攝入翅果油結合有規律的有氧運動對預防高血脂、動脈粥樣硬化及脂肪肝的發生具有一定的作用。