液氮冷凍處理對養殖大黃魚保鮮品質及菌群結構的影響

張登科,陳 姣,吳林潔,楊巨鵬,陳世達,張慧恩,楊 華,*,婁永江

(1.寧波大學海洋學院,浙江寧波 315211;2.浙江萬里學院生物與環境學院,浙江寧波 315100)

大黃魚(Pseudosciaenacrocea)是中國海水養殖產量最高和最具出口優勢的水產品之一[1]。大黃魚肉質細嫩,蛋白質含量高,膽固醇含量低,含有豐富的無機鹽及微量元素,具有延緩衰老,提高機體免疫力,治療貧血等多重功效[2]。大黃魚肌肉中水分含量高達74%[3],腐敗菌組成復雜,比動物組織更易腐敗,不易貯藏,現階段實際生產中對于大黃魚等水產品的保藏,國內外依舊主要采用低溫保藏技術[4-5],但一般的冰溫和冷藏保鮮不能大幅度延長水產品的貨架期,而經過凍藏后易出現口感降低、營養價值損失的問題[6-7]。所以尋求一種適于大黃魚的凍藏前處理方式對促進養殖、加工及貯運等產業極為重要。

液氮冷凍是將食品放入液氮中或將液氮噴灑在食品表面,讓液氮與食品表面充分接觸,巨大的溫差使液氮在極短的時間內除去食品中的熱量,從而使食品達到凍結狀態。液氮的凍結速度快,能夠在較短的時間內度過食品的冰晶形成期,對食品原有的營養和質構特性影響很小[8]。液氮處理食品超低溫會改變食品中原有的微生物群落結構,凍結狀態使食品本身的化學變化變得更加緩慢,從而達到食品保鮮效果[9]。目前液氮凍結技術在水產品上的運用逐漸增多,魯珺等[7-8]研究結果表明液氮深冷速凍對三疣梭子蟹、帶魚及銀鯧的凍藏品質均具有較好的維持效果。

現階段國內外研究重點側重于液氮冷凍處理對水產品理化品質的影響,對于水產品在液氮冷凍處理在儲藏過程中理化指標與內源酶、菌群結構等因素的相關聯系研究較少。本文以新鮮養殖大黃魚為原料,采用液氮浸漬凍結處理,分析養殖大黃魚在低溫貯藏條件下新鮮度品質及菌群結構的變化情況,為養殖大黃魚的液氮冷凍處理保鮮提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

養殖新鮮大黃魚 購于寧波路林市場,用冰盒運回實驗室;硫代巴比妥酸、甲基紅、溴甲酚綠、硼酸、鹽酸、三氯乙酸、乙醇、甲苯、甲醛、碳酸鉀、鹽酸三甲胺、苦味酸、無水硫酸鈉、氫氧化鈉、高氯酸、氫氧化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈉 純度≥99.5%,均為分析純(AR),國藥集團化學試劑有限公司;營養瓊脂培養基 杭州微生物試劑有限公司。

PL2002型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;Forma-725型超低溫冰箱 澳柯瑪股份有限公司;Centrifuge 5804R型離心機 德國Eppendorf 5804R;YXQ-LS-50SII型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;HWS型恒溫恒濕培養箱 寧波江南儀器廠;7230G可見光光度計 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;SKD-1000型自動凱氏定氮儀 上海天齊生物科技有限公司;e2695型高效液相色譜儀 上海瑞玢國際貿易有限公司;FE20型pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DK-8D型恒溫水浴鍋 上海維誠儀器有限公司;BCD-216ZDJ型可調式冰箱 青島海爾股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的預處理及分組 將養殖的新鮮大黃魚去鱗、去內臟,剖成兩片,取去皮魚肉切分成5 g的小塊。一部分進行真空包裝,另一部分直接放入液氮中浸漬5 min后真空包裝。未進行液氮浸漬處理的樣品為空白組,經液氮浸漬處理的樣品為液氮組,將所有樣品放入4 ℃冰箱儲藏14 d,在儲藏過程中,菌落總數1 d測定一次,測定前7 d;其它品質指標每2 d測定一次。

1.2.2 硫代巴比妥酸值(TBA)的測定 參照胡慶蘭[10]的方法,各取5 g樣品研碎,加入25 mL 7.5%的三氯乙酸(含有0.1% EDTA),振蕩搖勻,靜置30 min后用雙層濾紙過濾2次。取5 mL上清液于離心管內,加入5 mL 0.02 mol/L TBA溶液,放入沸水浴40 min后取出冷卻1 h,10000 r/min離心25 min,取清液于試管內,加入5 mL氯仿搖勻,靜置分層后取上清液分別在532 nm和600 nm波長處比色。

K(%)=(WHχR+WHχ)/(WATP+WADP+WAMP+WIMP+WHχR+WHχ)×100

1.2.3 三甲胺(TMA)的測定 參照姜興為[11]的方法進行檢測。稱取5 g攪拌均勻的魚肉于250 mL具塞三角燒瓶中,加入20 mL 7.5%三氯醋酸(TCA),搖晃使混合均衡,在室溫下靜置30 min后用濾紙過濾。吸取4 mL萃取液到25 mL的比色管內,然后分別再加入3 mL飽和碳酸鉀溶液、10.00 mL甲苯、1 mL碳酸鎂甲醛溶液,用力振搖1 min后,靜置5 min。然后將上層甲苯層分別移入內有0.5 g無水硫酸鈉的有蓋試管中,進行脫水處理。取5.00 mL處理過的甲苯溶液,再加苦味酸甲苯溶液5.00 mL,混勻后。用1 cm比色皿,參比液為空白試劑,在波長410 nm處測定各樣品的吸光值。

按照以下公式計算TMA值。

式中:A為測定管TMA含量(μg)。

1.2.4 揮發性鹽基氮(TVB-N)的測定 參照SC/T3032-2007水產品中揮發性鹽基氮的測定[12]進行檢測。

1.2.5 K值的測定 參照SC/T3048-2014魚類鮮度指標K值的測定高效液相色譜法[13]進行測定。稱取大黃魚樣品(2±0.02) g于燒杯,均質后放入離心管內,加人20 mL 10%(v/v)高氯酸溶液,振蕩1 min,然后在4 ℃,8000 r/min離心10 min,取出上清液。再用10 mL 5%(v/v)高氯酸溶液提取沉淀物中的待測物,4 ℃,8000 r/min離心10 min。重復操作一次,合并上清液。用10 mol/L的氫氧化鈉溶液調節提取液pH至近6.0,然后再用1 mol/L的氫氧化鈉溶液繼續調節pH至6.0～6.4。將已調節pH后的溶液轉移至50 mL容量瓶中,用4 ℃水定容。將定容后的溶液4 ℃,8000 r/min離心10 min,然后用0.22 μm微孔濾膜過濾,最后將濾液放入高效液相色譜儀檢測。按照以下公式計算K值。

K(%)=(WHχR+WHχ)/(WATP+WADP+WAMP+WIMP+WHχR+WHχ)×100

式中:WATP-樣品中腺苷三磷酸的含量,μmol/g;WADP-樣品中腺苷二磷酸的含量,μmol/g;WAMP-樣品中腺苷酸的含量,μmol/g;WIMP-樣品中肌苷酸的含量,μmol/g;WHxR-樣品中次黃嘌呤核苷的含量,μmol/g;WHx-樣品中黃嘌呤的含量,μmol/g。

1.2.6 菌落總數的測定 參照GB/T4789.2-2010食品衛生微生物學檢測-菌落總數測定[14]進行檢測。

1.2.7 微生物菌群結構的鑒定 樣品前處理:將用液氮浸漬5 min和未浸漬的魚肉置于37 ℃培養箱中24 h,然后加入適量無菌生理鹽水,勻漿,稀釋后用PCA培養后,選取各個菌落進行分離純化。

細菌DNA提取:用無菌的接種環提取分離純化后的菌體,接種到10 mL的TSB培養液中培養過夜(增菌)。取1 mL過夜培養的菌液,加入1.5 mL離心管中,室溫8000 r/min離心1 min,棄上清液,收集菌體。加入180 μL溶菌酶溶液,重懸菌液,37 ℃水浴30～60 min。再加入20 μL PrpteinaseK溶液,振蕩均勻。56 ℃水浴30 min至細菌完全裂解。依次加入200 μL BufferBD、200 μL無水乙醇充分顛倒混勻。將吸附柱放入收集管中,用移液器將溶液和半透明纖維狀懸浮物全部吸入吸附柱中,靜置2 min,再12000 r/min室溫離心1 min,倒掉收集管中的廢液。將吸附柱放回收集管,加入500 μL PW Solution,10000 r/min離心30 s倒掉濾液。將吸附柱放回收集管,加入500 μL Wash Solution,10000 r/min離心30 s倒掉濾液。將吸附柱重新放回收集管中,于12000 r/min室溫離心2 min,離去殘留的Wash Solution。取下吸附柱,放入一個新的1.5 mL的離心管中,加入50～100 μL CE Buffer靜置3 min,12000 r/min室溫離心2 min,收集DNA溶液。DNA產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析,在凝膠成像系統中成像觀察,并將提取后的DNA置于-20 ℃下保存備用[15]。此DNA即PCR反應模板。

PCR擴增16S rDNA基因片段:采用通用引物PCR擴增16S rDNA基因片段,建立25 μL PCR反應體系,包括:7.8 μL rTaq酶、1.0 μL DNA模板、上下游引物25 μmol/L各1 μL,用滅菌的去離子水(ddH2O)補至總體積25 μL。擴增程序:95 ℃預變性5 min,95 ℃變30 min,53 ℃退火1 min,72 ℃延伸90 s;30個循環,最后72 ℃保持10 min。純化的PCR產物于-20 ℃保存[16]。16S rDNA擴增引物采用通用引物,正向引物有27F:5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3′,反向引物為1492R:5′-GGTTACCTT GTTACGACTT-3′,由上海捷瑞生物工程有限公司合成。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析,然后在凝膠成像系統中成像觀察。

16S rDNA序列測定及分析:將擴增成功的PCR產物送至上海生物工程有限公司進行測序,將測序結果導入NCBI的Blastn檢索系統,在Nucleotide 數據庫中進行序列同源性比對。

1.3 數據處理

使用Office excel 2003軟件進行數據處理及繪圖。

2 結果與分析

2.1 TBA的變化與分析

養殖大黃魚在貯藏過程中,魚體內的油脂會自發的發生氧化反應,氧化產物分解生成低級脂肪酸、醛、酮等物質。硫代巴比妥酸(TBA)反應的原理是脂肪氧化產生的1分子丙二醛(MDA)與2分子TBA反應生成復合物,此復合物的最大吸收峰在532 nm處[17]。丙二醛的濃度和吸收強度在一定范圍內呈線性關系,由此可以確定脂肪氧化程度[18]。從圖1中可以看出2種不同的養殖大黃魚樣品的初始TBA值非常接近,液氮組的樣品為(0.60±0.12) mg/100 g,空白組的樣品為(0.65±0.05) mg/100 g。從TBA值的增長趨勢可以看出,養殖大黃魚儲藏初期的脂肪氧化較為緩慢,儲藏后期脂肪氧化的速度開始加快。在第14 d的時候,液氮組樣品的TBA值為(1.71±0.08) mg/100 g,空白組樣品的TBA值為(2.10±0.43) mg/100 g,可以看出在儲藏終點時兩者的脂肪氧化程度相差較大,液氮組與空白組擬合方程斜率分別為0.07和0.10,液氮組的脂肪氧化程度的平均增長速率低于空白組。

圖1 養殖大黃魚貯藏過程中TBA變化Fig.1 Changes of TBA during storage of cultured large yellow croaker

2.2 TMA的變化與分析

氧化三甲胺(TMAO)是一種廣泛分布于海產硬骨魚類肌肉中的內源性物質。TMAO經兼性厭氧菌的還原會產生三甲胺(TMA),魚體內三甲胺的含量隨鮮度的下降而逐漸增加[19]。魚類(主要是海水魚)含有的氧化三甲胺含量與魚的種類和生長環境有關。Huss等[20]曾報道過冷水魚高品質期的TMA值小于1.5 mg/100 g,可接受界限為10～15 mg/100 g。從圖2中可以看出液氮組和空白組的初始TMA值都較低,分別為(0.47±0.02) mg/100 g和(0.52±0.01) mg/100 g,儲藏初期,TMA值的增長速度很慢,隨著時間的延遲,TMA值的增長也開始加快,第14 d時液氮組和空白組的TMA分別為(5.46±0.037) mg/100 g和(6.99±0.008) mg/100 g,但是液氮組與空白組擬合方程斜率分別為0.36和0.46,液氮組樣品的TMA值增長速度更為緩慢。

圖2 養殖大黃魚貯藏過程中TMA的變化Fig.2 Changes of TMA during storage of cultured large yellow croaker

2.3 TVB-N的變化與分析

揮發性鹽基氮(TVB-N)是一個衡量肉質新鮮度的理化指標,TVB-N越低,則表示肉質越新鮮。揮發性鹽基氮主要由三甲胺,二甲胺和氨組成,這些物質來自于內源性酶蛋白和非蛋白氮化合物的降解[21]。很多魚類TVB-N的變化與肉質新鮮度指標之間有很好的相關性,我國以及多數國家已將TVB-N作為鑒定水產品腐敗程度的標準。我國國標規定30 mg/100 g是水產品品質可接受范圍的上限,高于這個值將不能被食用。TVB-N值低于13 mg/100 g時為一級鮮度,低于30 mg/100 g為二級鮮度[22]。由圖3可知,液氮組和空白組的樣品初始TVB-N分別為(10.28±0.40) mg/100 g和(10.06±0.23) mg/100 g,處于一級鮮度范圍內,說明此時養殖大黃魚樣品的還是很新鮮的。隨著儲藏時間的增長,養殖大黃魚樣品的TVB-N值也在不斷變大。空白組在儲藏第2 d時,TVB-N值已達到(14.7±0.16) mg/100 g,已屬于二級鮮度范圍內,而液氮組在儲藏第4 d時,TVB-N值才達到(15.6±0.34)mg/100 g,此時仍屬于二級鮮度范圍內。兩者的趨勢線相比,液氮組與空白組擬合方程斜率分別為1.08和1.20,液氮組平均增長速率和空白組相近。

圖3 養殖大黃魚貯藏過程中TVB-N的變化Fig.3 Changes of TVB-N during storage of cultured large yellow croaker

2.4 K值的變化與分析

K值是腺苷三磷酸降解產物次黃嘌呤核苷、次黃嘌呤量之和與腺苷三磷酸關聯化合物總量的百分比。魚類死后K值的變化能夠很好的反映其營養成分與鮮活質量的變化。K值低于20%時魚類為一級鮮度,低于50%為二級新鮮,高于70%則被定義為完全腐敗。K值越小則表示魚類越新鮮。一般魚類死亡后受到微生物和自身酶的作用,營養成分逐漸降解,鮮度逐漸下降。在鮮度下降過程中,肌肉中的腺苷三磷酸(ATP)會逐漸分解,依次分解為腺苷二磷酸(ADP),腺苷酸(AMP),肌苷酸(IMP),次黃嘌呤核苷(HxR),黃嘌呤(Hx),導致肌肉呈苦味[23]。從圖4可知,兩組樣品的初始K值分別為液氮組9.5%±0.1%,空白組為9.1%±0.06%,表示液氮處理對K值的初始值沒有影響。儲藏早期K值的增長較緩慢,第14 d時液氮組和空白組的K值分別為45.1%和55.6%。隨著時間的延遲,增長速度變大。兩者的趨勢線相比,液氮組與空白組擬合方程斜率分別為2.55和3.36。液氮處理的養殖大黃魚樣品的K值在后期儲藏中始終低于未處理的養殖大黃魚樣品。

圖4 養殖大黃魚貯藏過程中K值的變化Fig.4 Changes of K value during storage of cultured large yellow croaker

2.5 菌落總數的變化與分析

初始菌落總數是一個非常重要的指標,它不僅能指示魚類的初始新鮮程度,而且會影響養殖大黃魚在冰藏期間的腐敗進程[24-25]。從圖5中可以看出,經過液氮處理后,養殖大黃魚樣品的初始菌落總數有了明顯的減少,液氮組的初始菌落總數的對數值為(3.63±0.016) cfu/g,空白組的對數值為(5.38±0.019) cfu/g;液氮組與空白組相比，經液氮處理后的樣品，菌落總數下降了98.21%；說明液氮冷凍處理抑制了大部分的微生物的增殖,只有少數耐低溫的微生物得以繁殖,液氮處理養殖大黃魚具有良好的抑菌效果。在儲藏過程中,兩組的菌落總數都呈對數增長,從增長趨勢可以看出,液氮組與空白組擬合方程斜率分別為0.76和0.65,菌落總數的平均增長率液氮組高于空白組,這是由于空白組中初始菌落總數高于液氮組,而樣品中微生物的增殖需要適宜的條件,兩組魚肉中營養物質大致相同,所以在儲存過程中液氮組的菌落總數增長率高于空白組,但是液氮組菌落總數一直低于空白組。

圖5 養殖大黃魚貯藏過程中菌落總數的變化Fig.5 Changes of the total number of colonies during storage of cultured large yellow croaker

2.6 微生物菌群結構分析

通過對所有樣品中微生物的16S r RNA基因的測序,如圖6所示,在門水平上分析空白組樣品中優勢菌為變形菌門(Proteobacteria)72.65%、其次為厚壁菌門(Firmicutes)23.38%和擬桿菌門(Bacteroidetes)3.96%,除了這些主要菌門外,還存在有一些豐度較低的放線菌門(Actinobacteria)、異常球菌-棲熱菌門(deinococcus-Thermus)、梭桿菌門(Fusobacteria)以及其它未能分類(unclassified)菌門,有的所占百分比不足 0.01%,圖中顯示不明顯。液氮組樣品中優勢菌種類和空白組大致相同,只是比例有所變化,優勢菌為變形菌門(Proteobacteria)65.60%、其次為厚壁菌門(Firmicutes)23.91%和擬桿菌門(Bacteroidetes)10.11%,其它菌門細菌含量也均很低。說明了養殖大黃魚在貯藏過程中微生物多樣性豐富,豐度比較集中的特點。但液氮冷凍處理對其種類影響不大,對其豐度有較多影響。

圖6 養殖大黃魚樣品中細菌在門水平上的相對豐度分析Fig.6 Analysis of relative abundance of bacteria at the Phylum level in cultured large yellow croaker

在屬水平上分析,如圖7所示,空白組樣品中優勢菌為氣單胞菌屬(Aeromonas)37.72%、其次為漫游球菌屬(Vagococcus)21.99%、變形桿菌屬(Proteus)17.35%、不動桿菌屬(Acinetobacter)5.70%和類香味菌(Myroides)3.67%,其它菌屬細菌含量均較低,圖中僅列出豐度為前15的細菌種類。液氮組樣品中優勢菌為氣單胞菌屬(Aeromonas)44.87%、其次為漫游球菌屬(Vagococcus)18.83%、不動桿菌屬(Acinetobacter)13.28%和類香味菌(Myroides)10.17%,其它菌屬細菌含量均較低。從結果上來看,液氮冷凍處理對養殖大黃魚儲存期的菌落結構是有一定影響的。空白組和液氮組細菌中氣單胞菌屬含量都是最大的,但液氮組氣單胞菌屬所占總細菌的比值略高于空白組,魚類中主要腐敗菌包括氣單胞菌屬,這與研究結果是相符合的[26-27]。變形桿菌屬(Proteus)在空白組細菌總量中占有較多比例,但其在液氮組中幾乎沒有。說明液氮冷凍處理對部分微生物具有殺菌效果。

圖7 養殖大黃魚樣品中細菌在屬水平上的相對豐度分析Fig.7 Analysis of relative abundance of bacteria at the genus level in cultured large yellow croaker

由圖8中可以比較空白組和液氮組在某分支上的豐度差異,在門水平上,在物種豐度上進行比較,兩組樣品除擬桿菌門(Bacteroidetes)液氮組高于空白組,其它細菌種類豐度差別不大。在綱水平上,除β-變形菌綱(Betaproteobacteria)和梭菌綱(Clostridia)空白組高于液氮組,但β-變形菌綱和梭菌綱豐度并不高,其它細菌種類豐度和門水平上的結果基本一致。兩組在目水平上,細菌種類豐度逐漸出現較大差距。綜上所述,液氮冷凍處理對養殖大黃魚貯藏期菌群結構有一定影響,但主要表現在目、科、屬水平上。而菌落結構的改變是否對養殖大黃魚儲藏期品質變化有所影響,還需進一步實驗進行驗證。

圖8 屬水平上所有樣品豐度前30的物種分類系統組成樹狀圖Fig.8 The level of all genus on the abundance of the top 30 species classification system composed of tree

3 結論

液氮冷凍處理養殖大黃魚能夠降低儲藏期TBA的增長速度,抑制魚肉脂肪的氧化,更好的保持大黃魚的品質,延長貨架期;能夠降低TMA的增長速度,減少不良氣味的生成,降低魚肉鮮度下降的速度;能夠降低TVB-N的增長速度,減少內源性酶蛋白和非蛋白氮化合物的降解,更好的保證魚肉的品質,延遲腐敗的進程;液氮處理能夠降低K值的增長速度,減少營養成分的分解和鮮度的下降,延長保質期;液氮冷凍處理能夠降低其菌落總數,并改變其菌群結構,具有良好的抑菌及殺菌效果。綜上所述,液氮冷凍處理能夠延遲養殖大黃魚腐敗變質的進程,讓大黃魚能夠保存更長的時間。

本文初步探究了液氮冷凍處理對大黃魚菌群結構的影響,結果表明液氮冷凍處理養殖大黃魚對其菌群結構有一定影響,對部分微生物具有殺菌效果,而菌群結構的改變對養殖大黃魚儲藏期品質變化的具體影響及相互聯系還需進一步研究。此外,魚肉中還含有大量的內源酶,包括蛋白酶、脂肪酶等,液氮冷凍處理在影響魚肉保鮮品質的同時,也會對魚肉蛋白質結構和功能特性產生影響,探究液氮冷凍處理對養殖大黃魚蛋白質的功能特性及理化指標的影響,對控制魚肉品質,探究影響機理具有重要意義。