基于微滴數字PCR阿膠定量檢測方法的建立

王一村,蘇本玉，李 娜,許士明,高靜靜,周莉莉

(山東省產品質量檢驗研究院/國家加工食品質量監督檢驗中心,山東濟南 250102)

阿膠也稱驢皮膠,與人參、鹿茸一起被稱為“中藥三寶”[1]。其補血、增強免疫力、抗疲勞、抗輻射、抑制腫瘤、保護大腦、促進骨愈合生長以及保護心血管等功效都已被證實[2-4]。阿膠產業蓬勃發展,現已融入健康中國發展戰略。然而,在巨大經濟利益的誘惑下,阿膠行業內制假售假現象嚴重[5-6]。假阿膠及其制品雖在外觀、氣味、質地、口感等方面與真品無明顯差異,但阿膠純度低。有些摻假阿膠甚至威脅人體健康,嚴重擾亂了阿膠市場秩序。當前,阿膠的真假鑒別和純度鑒定是該行業急需解決的瓶頸難題。

大量學者已建立并應用各類方法去辨別阿膠的真偽,比如高效液相色譜及質譜法[7-8]、光譜法[9-10]、酶聯免疫法[11]、電泳法[12-13]以及分子生物學方法[14-15]等,但仍然無法對阿膠純度和品質進行評估和評價。要從根本上解決此類問題,對阿膠進行定量分析才是關鍵。由于技術上的難點,目前行業內阿膠定量分析研究極少,幾乎處于研究空白。令人欣喜的是,微滴數字PCR的出現有望解決阿膠定量這一難題。

微滴數字PCR(ddPCR)是一種對核酸進行精確定量的全新方法[16-17],它利用有限稀釋及波松分布分析對目的DNA的拷貝數進行絕對定量[18]。因此對于源性成分分析來說,ddPCR不僅能進行定性分析,更重要的是能進行精確定量。該方法不依賴標準曲線和對照、不受PCR抑制物及PCR效率的影響,通過單分子計數方式實現基因拷貝數的定量,是絕對意義上的定量[19]。目前,ddPCR技術在源性成分摻假的定量檢測上已初見鋒芒,而且在鑒定市售相關產品中取得了較大成績[20-23]。因此,將該技術引用到阿膠及其制品的定量檢測上是完全可行的。阿膠是以驢源性成分為唯一動物來源的產品,本研究應用ddPCR技術,通過測定阿膠中驢源性成分的絕對含量達到對阿膠進行定量分析的目的。該方法的建立有望對市場上阿膠產品進行純度測定,從而突破現階段無法對阿膠及其相關產品進行純度評價的難題。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

阿膠純品標準樣、驢皮、馬皮、豬皮及牛皮 由山東宏濟堂制藥集團濟南阿膠制品有限公司提供;生鮮羊肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、鵪鶉肉以及水稻、小麥、花生、杏、玉米、大豆 濟南市內農貿市場;明膠粉(分析純) 天津市大茂化學試劑廠;貂皮和狐貍皮 由山東泰安市某養殖基地提供;8個品牌阿膠及2個阿膠速溶粉 普通消費市場;DNA提取試劑盒 德國凱杰(QIAGEN)公司;驢源性引物和探針 由寶生物工程(大連)有限公司(Takara)合成;ddPCR Master Mix 美國伯樂(Bio-Rad)公司。

Bio-Rad QX200 ddPCR微滴生成儀 美國Bio-Rad公司;梯度PCR儀 美國Applied Biosystems公司;Nanodrop 1000生物紫外可見分光光度計 美國Thermo公司;EC3Darkroom凝膠成像儀 美國UVP公司;5424R冷凍離心機 德國Eppendorf公司;DW-86L286超低溫冰箱 美國T.F.S公司;BSA224S-CW電子天平 德國Sartorius公司;RCT磁力攪拌器、LAB DANCER漩渦振蕩器、A11分析研磨機 德國IKA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 阿膠樣品制備 取新開封阿膠或阿膠相關產品于分析研磨機中研磨,如樣品不易處理,可用液氮研磨。磨成粉后于烘箱中85 ℃烘24 h進行樣品稱取。將阿膠純品作為標準品,其他8個阿膠、2個市售阿膠粉及明膠粉經上述方法研磨烘干處理后作為待測品。樣品處理過程中不同樣品隔離處理,嚴防交叉污染。

1.2.2 DNA提取 各類產品及各類組織的DNA提取步驟嚴格按照QIAGEN試劑盒說明書進行。利用生物紫外可見分光光度計測定DNA含量,保證目的DNA的OD260/OD280比值在1.8～2.0范圍內,-20 ℃保存備用,于24 h內完成下一步實驗。

1.2.3 ddPCR檢測用引物探針 檢測阿膠中驢源性成分的引物探針序列參考國家出入境檢驗檢疫行業標準[24]合成。F:5′-AATAGCTCTAGCCGTACGGC TAACT-3′,R:5′-CAGGATAATGAATGTAATAAGGG CTG-3′,探針:5′-FAM-TGCCGGACATCTTCTAATCC ACCTT-ECLIPSE-3′。

1.2.4 ddPCR檢測程序 ddPCR反應采用20 μL體系:上下游引物各1.8 μL(900 nmol/L),探針0.8 μL(250 nmol/L),Bio-Rad ddPCR Master Mix 10 μL,模板4 μL,無菌水補齊至20 μL。利用微滴生成器將20 μL反應液生成不低于15000個DNA模板和試劑隨機分布的微滴。PCR反應程序如下:95 ℃ 10 min;94 ℃ 30 s;60 ℃ 1 min;98 ℃ 10 min;40個循環,4 ℃保存。最后用微滴分析儀對擴增產物進行分析,分析軟件為QuantaSoft。

1.2.5 引物探針特異性分析 應用兩種方法進行引物探針的特異性驗證,一是利用NCBI數據庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行引物探針序列的同源性比對分析。二是以試劑盒提取的驢源性DNA為陽性對照,阿膠中有可能摻假的馬、豬、牛、羊、雞、鴨、鵝、鵪鶉、貂、狐貍、水稻、小麥、花生、杏、玉米、大豆源性DNA為模板進行特異性ddPCR檢測分析。

1.2.6 阿膠質量與拷貝數換算公式的建立

1.2.6.1 阿膠質量與DNA含量的關系 分別稱取20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 mg共10個質量梯度的標準品阿膠粉末進行DNA基因組的提取,實驗步驟和操作保持嚴格一致。利用生物紫外可見分光光度計測定DNA含量,每個梯度樣品設置3個重復。

1.2.6.2 阿膠DNA含量與拷貝數的關系 依據測定后的阿膠DNA濃度對樣品DNA進行梯度稀釋,確定10個DNA濃度進行下一步ddPCR的檢測,從而確定各濃度梯度的目的DNA拷貝數,每個梯度重復3次。10個濃度梯度依次為10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 ng/μL,每次模板選用4 μL進行ddPCR檢測。

1.2.7 ddPCR準確性驗證實驗 為驗證所建方法的準確性,分別稱取10個質量分數梯度的阿膠粉與不含驢源性的明膠粉的混合品進行DNA提取。混合品總質量為100 mg,10個梯度樣品中阿膠粉含量依次為10%～100%,每個梯度以10%遞增。對混合樣品進行DNA提取,5倍稀釋后取4 μL進行ddPCR檢測。

1.2.8 市售樣品的檢測 將從市場上搜集到的不同品牌的阿膠及阿膠速溶粉經1.2.1處理后進行DNA提取,稀釋5倍后取4 μL進行ddPCR檢測。用所建立方法進行阿膠定量驗證實驗,驗證所建立方法的實際應用情況。所建方法測得阿膠含量的實際值與進行DNA提取的市售阿膠總質量的比值即為市售阿膠的純度。

1.3 數據處理

數據采用SPSS軟件進行處理和統計學分析,利用Microsoft Office Excel進行部分數據處理和圖表制作。

2 結果與分析

2.1 引物和探針的特異性分析

1.2.5中引物探針的同源序列比對分析未發現同源性高的其他物種存在,而且ddPCR的特異性驗證實驗并未發現該引物探針在除驢源性陽性DNA外的其他所檢物種DNA中出現交叉擴增,這說明所引用標準[24]中的引物探針特異性良好,符合本研究的要求。

2.2 阿膠質量與DNA含量關系確定

利用1.2.6.1的方法確定阿膠質量與DNA含量的關系。結果表明阿膠在20～200 mg質量范圍內,阿膠質量與相應質量提取到的DNA含量之間呈現線性關系,相關系數R2可達0.9963(圖1),說明相關性顯著。

圖1 阿膠質量與相應DNA含量的關系Fig.1 The linear relationship between quantity of Donkey-hide Gelatin(mg)and corresponding DNA content(ng)

2.3 DNA含量與基因拷貝數關系確定

利用1.2.6.2的方法確定阿膠DNA含量與目的基因拷貝數的關系。結果顯示ddPCR在檢測過程中,每個樣品的微滴生成量均在15000以上,完全滿足定量檢測的需求。從圖2中可以看出,在選用的阿膠DNA濃度范圍(10～100 ng)內,即阿膠DNA質量在40～400 ng質量范圍內,DNA含量與目的基因拷貝數之間呈現線性關系,相關系數R2可達0.9945(圖1),說明相關性顯著。

圖2 阿膠DNA含量與目的基因拷貝數的關系Fig.2 The linear relationship between DNA content(ng) and the target DNA copy number

2.4 阿膠質量與目的基因拷貝數關系確定

根據2.2中確立的阿膠質量與DNA含量之間的關系,以及2.3中確立的阿膠DNA含量與目的基因拷貝數之間的關系,以阿膠DNA含量為中間過渡換算值,確定出阿膠質量與目的基因拷貝數之間的線性關系為M阿膠=0.13C+3.05。其中,M阿膠為阿膠的質量(mg),C為每微升的目的基因拷貝數(copies/μL)。

2.5 ddPCR準確性驗證實驗

為了驗證所建立方法的準確性和實用性,分別提取已知阿膠質量的阿膠與明膠的10個梯度混合樣品提取DNA,稀釋5倍后進行ddPCR的檢測,按2.4中建立的阿膠質量與目的基因拷貝數的關系確定混合樣品中的實測阿膠質量與實際質量進行比對,每個梯度重復3次。值得注意的是,DNA的提取過程受其他因素的影響較大,比如不同樣品間的差異、樣品處理的差異、DNA降解、操作差異甚至污染等等,如3次樣品DNA濃度檢測結果差異明顯,應重新進行DNA提取。

驗證實驗的結果如表1所示。從結果可以看出,實際測得的數值與真實值基本保持一致,最大實測偏差僅為4.0%,平行樣品穩定性良好。這表明本研究所建立的利用ddPCR對阿膠進行定量檢測的方法穩定可靠。

表1 已知質量的阿膠ddPCR定量驗證Table 1 Quantitative verification of Donkey-hide Gelatin with given concentrations by ddPCR

2.6 市場內不同阿膠及阿膠產品的檢測

使用本研究建立的ddPCR阿膠定量檢測方法,對市場內銷售的不同品牌的8款阿膠及2款阿膠附屬產品阿膠速溶粉進行定量檢測,計算每個阿膠產品的純度。每個樣品經DNA提取后,稀釋5倍檢測,重復3次,結果如表2所示。從結果可以看出,在阿膠產品中,1、3和4號阿膠純度較高,純度均在90%以上,尤其是3號樣品,阿膠含量略高于本研究中的標準品。6、7、8號阿膠含量次之,2和5號產品阿膠含量相對較低,而2號僅為23.3%。對于阿膠產品阿膠速溶粉來說,阿膠含量分別為44.8%和39.8%。這說明現市場上銷售的各類阿膠及其產品質量參差不齊,純度有較大差異。以上結果再次說明本研究開發的ddPCR方法能夠進行阿膠及其相關產品中阿膠含量的定量檢測,可以用來進行阿膠及相關產品的摻假和純度鑒定,有很高的實用性。

表2 市場內阿膠與阿膠相關產品的定量分析Table 2 Quantitative analysis of Donkey-hide Gelatin and its subsidiary products

3 結論

阿膠的主要原材料是驢皮,本研究通過建立阿膠質量與驢源性基因拷貝數的關系,利用ddPCR技術檢測阿膠的絕對含量。研究表明,在一定質量范圍內,阿膠質量與DNA含量呈線性關系。在一定DNA濃度范圍內,DNA含量與DNA絕對拷貝數間亦呈線性關系。利用三者間的兩兩線性關系,以DNA含量為中間換算值,得到阿膠質量與DNA絕對拷貝數間公式為M阿膠=0.13C+3.05。利用此公式,通過檢測未知樣品中驢源性基因的DNA絕對拷貝數來得到樣品中阿膠的絕對含量。準確性驗證實驗結果表明阿膠含量實測值與真實值基本保持一致,實測值偏差最大僅為4%,這說明本研究建立的方法準確可靠。為進一步驗證該方法的應用能力,選用市場上銷售的8款阿膠及2款阿膠附屬產品阿膠速溶粉進行定量檢測,結果發現8款阿膠中,3款阿膠純度較高,純度均在90%以上,2款純度較低,最低的純度僅為23.3%。這說明市場上銷售的不同品牌阿膠間的阿膠純度差異大,質量參差不齊。而2款阿膠速溶粉的阿膠純度均在40%左右,這與速溶粉中添加了其他營養物質或成分有關。

以上結果表明本研究建立的ddPCR方法檢測阿膠含量準確、可靠。該技術可填補阿膠行業定量檢測空白,緩解市場中阿膠及相關產品造假嚴重的突出現狀,亦可為政府監管提供依據及科技支撐,該研究具有廣闊的應用前景,并可產生可觀的經濟效益,對阿膠行業發展將起到引領和重要的示范作用。