超高效液相色譜熒光檢測法測定水果中3種萘衍生物

仲伶俐,李 曦,郭靈安,李華仙,雷欣宇,付成平,趙 珊

(四川省農業科學院分析測試中心,四川成都 610066)

萘衍生物1-萘乙酰胺(NAD)、1-萘乙酸(NAA)和2-萘氧乙酸(2-NOA),屬生長素類植物生長調節劑,在果樹上使用能加強植株的新陳代謝和光合作用,刺激生長,促進坐果和增大果粒等[1]。我國規定蘋果、葡萄和荔枝中NAA最大殘留限量(MRL)分別為0.1、0.1、0.05 mg/kg[2],對應的檢測方法標準有SN 0346氣相色譜法(GC法),檢測限0.02 mg/kg[3],SN/T 2228氣相色譜-質譜(GC-MS)法,檢測限0.01 mg/kg,需要三甲基硅烷化重氮甲烷衍生化,操作較復雜[4]。日本規定NAA在水果、蔬菜等產品中的最大殘留限量為0.03～5.0 mg/kg,NAD在蘋果和梨中的限量為0.1 mg/kg[5]。歐盟規定NAD、NAA、2-NOA在漿果類水果中的最大殘留限量分別為0.05、0.05、0.01 mg/kg[6]。NAA相關的測定方法已較成熟,除了上述標準方法GC法和GC-MS法外,主要有熒光法[7]、液相色譜-紫外檢測法(HPLC-UV)[8-9]、液相色譜-熒光檢測法(HPLC-FLD)[10]、液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)[11-13]。而國內外對NAD和2-NOA的測定研究較少,汪偉[14]建立了NAA和2-NOA的HPLC-UV測定法。X Esparza[15]等建立了HPLC-MS/MS分析蘋果中NAD、NAA和NOA的方法,并研究了施藥后蘋果樣品中NAD、NAA和NOA殘留情況及NAD和NAA的降解規律。HPLC-MS/MS靈敏度和選擇性高,但儀器昂貴。水果樣品基質復雜,采用HPLC-UV測定萘衍生物選擇性不高,易干擾定性和定量分析。

目前我國沒有NAD和2-NOA的限量規定和相應的檢測方法標準,還未見有文獻報道采用液相色譜-熒光檢測法同時測定NAD、NAA和2-NOA。QuEChERS法作為一種快速、簡便的殘留提取凈化技術,在農藥多殘留檢測中得到廣泛應用[16]。本文采用超高效液相色譜-熒光檢測(UPLC-FLD)法,結合QuEChERS法低成本、簡便快速的前處理技術,建立同時測定水果中NAD、NAA和2-NOA的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

NAD、NAA和2-NOA標準品 純度均>99.0%,德國Dr. Ehrenstorfer公司;甲酸 色譜純,上海安譜實驗科技股份有限公司;甲醇、乙腈、二氯甲烷 色譜純,美國sigma-aldrich公司;氯化鈉 分析純,西隴化工有限公司;NH2固相萃取小柱 500 mg/6 mL,美國Thermo公司;PSA填料、C18填料、無水硫酸鎂(MgSO4) 美國Agilent公司;實驗用水 優普超純水系統制備;草莓、蘋果、柑橘、葡萄、荔枝(去核、去殼，切塊后用料理機制備成勻漿狀的水果樣品) 市售。

Agilent 1290超高效液相色譜儀(配有熒光檢測器) 美國Agilent公司;waters e2695高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測器) 美國Waters公司;LD5-2A高速離心機 北京京立離心機有限公司;WH-3微型渦旋混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司;DT-1002A電子天平 常熟市金羊砝碼儀器有限公司；Braun Multiquick 3 K 600料理機 德國博朗公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

1.2.1.1 提取溶劑和提取方法的選擇 提取①:稱取10 g制備好的勻漿狀水果樣品于100 mL具塞離心管中,加入20.0 mL乙腈,渦旋2 min,加入約5 g氯化鈉,蓋上蓋子,劇烈振搖1 min,4000 r/min離心5 min,使乙腈和水相分層。取10 mL乙腈層于50 mL梨形瓶中,于40 ℃下旋轉蒸發濃縮至近干,洗耳球吹干,用4 mL二氯甲烷-乙腈(9∶1,V/V)淋洗液(A.含0.2%甲酸;B.含0.5%甲酸;C.含1%甲酸)溶解殘渣,待SPE凈化。

提取②:稱取10 g制備好的勻漿狀水果樣品于100 mL具塞離心管中,加入10.0 mL乙腈溶液(A.含1%甲酸;B.含2%甲酸),渦旋2 min,加入約5 g氯化鈉,蓋上蓋子,劇烈振搖1 min,4000 r/min離心5 min,使乙腈相和水相分層。待QuEChERS凈化。

1.2.1.2 凈化方法的選擇 SPE凈化:用5 mL二氯甲烷-乙腈(9∶1,V/V)淋洗液(A.含0.2%甲酸;B.含0.5%甲酸;C.含1%甲酸)淋洗液活化NH2固相萃取小柱,棄去流出液,活化完成后加入提取①得到的待凈化樣液,用50 mL梨形瓶收集流出液,再用上述淋洗液洗滌NH2固相萃取小柱2次,每次3 mL,合并流出液,于30 ℃下旋轉蒸發濃縮至近干,洗耳球吹干,用乙腈-水(1∶1,V/V)溶液2 mL溶解殘渣,經0.22 μm微孔濾膜過濾后,供超高效液相色譜測定。

QuEChERS凈化:準確稱取一定質量的吸附劑(①50 mg PSA,50 mg C18,150 mg MgSO4;②25 mg PSA,25 mg C18,150 mg MgSO4)于2 mL離心管中,移取1 mL提取②得到的上層酸性乙腈提取液于該離心管中,將提取液與吸附劑(a. 1%甲酸-乙腈,50 mg PSA,50 mg C18,150 mg MgSO4;b. 2%甲酸-乙腈,50 mg PSA,50 mg C18,150 mg MgSO4;c. 1%甲酸-乙腈,25 mg PSA,25 mg C18,150 mg MgSO4;d. 2%甲酸-乙腈,25 mg PSA,25 mg C18,150 mg MgSO4)混勻,3000 r/min離心3 min,取0.5 mL上清液,加入0.5 mL水,混勻,經0.22 μm微孔濾膜過濾后,供超高效液相色譜測定。

1.2.2 儀器條件

1.2.2.1 色譜柱的選擇 比較ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm,2.1 mm×100 mm)和ACQUITY UPLC BEH phenyl(1.7 μm,2.1 mm×100 mm)2種色譜柱對化合物色譜分離的影響。

1.2.2.2 流動相的選擇 比較乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸2種流動相對色譜峰形和保留值的影響。

1.2.2.3 其它儀器條件 洗脫條件:乙腈-0.1%甲酸(25∶75,V/V)等度洗脫;流速:0.5 mL/min;熒光檢測波長:Ex=280 nm,Em=330 nm;柱溫:40 ℃;進樣量:4 μL。

1.2.3 標準曲線的繪制 分別準確稱取NAD、NAA、2-NOA標準品10.0 mg,用甲醇溶解并轉移至10 mL容量瓶中,定容至刻度,配制成1.0 mg/mL的標準儲備溶液,貯存于密閉的棕色玻璃瓶中。準確移取NAD、NAA和2-NOA標準儲備溶液各0.5 mL于50 mL容量瓶中,用甲醇稀釋成10 mg/L的混合標準溶液,并逐級稀釋成0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 mg/L的混合標準工作溶液,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,以峰面積為縱坐標,以濃度為橫坐標進行線性回歸,繪制標準曲線。

1.2.4 加標回收實驗 稱取樣品后加入一定量的標準溶液于樣品中,使得樣品中NAD、NAA和2-NOA的含量為0.01、0.1和1.0 mg/kg,混勻并靜置30 min,用1.2.1方法前處理,用1.2.2方法測定。

1.3 數據處理

采用Agilent 1290Ⅱ色譜工作軟件進行數據處理,得到標準曲線及回歸方程,用Excel 2007繪制,色譜圖由數據繪圖工具OriginPro 8繪制。

2 結果與討論

2.1 凈化方法的選擇

因草莓基質更加復雜，對測定的干擾相對其它水果更大，因此選取草莓樣品進行凈化方法的選擇和優化實驗。草莓樣品經乙腈提取,鹽析分層后進行凈化操作。由于3個化合物中NAA和2-NOA都有一定的酸性,實驗首先選擇了具有陰離子交換作用力的NH2固相萃取小柱凈化樣品,當樣液通過NH2小柱時,酸性化合物因離子交換作用被吸附,然后用酸性淋洗液進行洗脫,當淋洗液為含0.2%～1%甲酸的二氯甲烷-乙腈(9∶1,V/V)溶液時,NAD和NAA回收率能達到70%以上,但2-NOA回收率很低,增加洗脫溶劑的極性和洗脫體積,仍不能得到改善。后采用更加簡便、快速的QuEChERS法進行前處理。樣品經酸性乙腈提取,鹽析分層,PSA、C18和無水硫酸鎂吸附劑對提取液進行QuEChERS凈化后測定。通過比較不同提取溶劑和吸附劑用量組成條件(如1.2.1中所述)下目標化合物的回收率,如圖1所示,結果表明當吸附劑用量相同的條件下,提取溶劑中酸含量增加對2-NOA的回收率有明顯的提高,當提取溶劑相同的條件下,減少吸附劑用量能夠提高回收率。原因可能是PSA吸附劑在硅膠上鍵合了乙二胺丙基官能團,具有陰離子交換作用,在去除樣品中的有機酸、脂肪酸和糖等干擾物的同時,對分子結構中帶有羧基的化合物有一定的保留作用[17],當化合物所在溶劑環境達到一定的酸性條件下,這類化合物才能從吸附劑釋放出來。最終確定以2%甲酸-乙腈為提取液,25 mg PSA、25 mg C18和150 mg MgSO4進行QuEChERS法凈化,此條件下3個化合物均能獲得較好的回收率。

圖1 不同提取溶劑和吸附劑用量下的回收率Fig.1 The recoveries of different extraction solvents and adsorbent dosage注:a. 1%甲酸-乙腈,50 mg PSA,50 mg C18,150 mg MgSO4;b. 2%甲酸-乙腈,50 mg PSA,50 mg C18,150 mg MgSO4;c. 1%甲酸-乙腈,25 mg PSA,25 mg C18,150 mg MgSO4;d. 2%甲酸-乙腈,25 mg PSA,25 mg C18,150 mg MgSO4。

2.2 儀器條件的選擇與優化

用液相色譜二極管陣列檢測器掃描NAA得到其最大紫外吸收波長(UV)為220 nm,此波長選擇性低。用熒光檢測器對NAA進行掃描,得到其最佳激發波長(Ex)和發射波長(Em)分別為280、340 nm,用相同濃度的萘乙酸標準溶液分別在UV220 nm和Ex280 nm,Em340 nm下測定,比較萘乙酸在這兩個檢測器上的色譜峰響應,見圖2、圖3,結果表明萘乙酸在最大紫外吸收波長UV220 nm測得的色譜峰信噪比較低,熒光檢測器的靈敏度明顯高于紫外檢測器。用熒光檢測器對NAD和2-NOA進行掃描,這2個化合物的最佳激發波長和發射波長均在280 nm和330 nm附近,且NAA在發射波長為330 nm和340 nm下的響應差異很小,因此,綜合3個化合物的峰響應,本方法采用選擇性和靈敏度更高的熒光檢測器,在Ex280 nm,Em330 nm下測定NAD、NAA和2-NOA。

圖2 萘乙酸在UV220 nm的色譜圖Fig.2 Chromatogram of NAA on UV220 nm

圖3 萘乙酸在Ex280 nm,Em340 nm的色譜圖Fig.3 Chromatogram of NAA on Ex280 nm,Em340 nm

通過比較ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱和ACQUITY UPLC BEH phenyl色譜柱在乙腈-水,乙腈-0.1%甲酸不同流動相條件下對色譜分離的影響,發現乙腈-水為流動相時色譜峰較寬,峰形不對稱,而乙腈-0.1%甲酸為流動相能夠改善色譜峰形,對保留值并無影響。在相同的流動相條件下phenyl色譜柱對NAA和2-NOA的保留沒有C18色譜柱強,而對NAD的保留差異不大。為了實現更快速的分離,實驗選擇phenyl色譜柱,以0.1%甲酸-乙腈為流動相等度洗脫,在0.5 mL/min的流速下3個化合物在6 min內能得到很好的分離,色譜峰尖銳對稱(如圖4所示)。由于水果品種較多,選擇基質干擾較其它水果更大的草莓樣品的圖譜作為代表,從草莓空白樣品和加標樣品色譜圖(圖5、圖6)可以看出,該條件下NAD、NAA和2-NOA在樣品中基本無色譜干擾。

圖4 3種萘衍生物標準色譜圖Fig.4 Chromatogram of 3 naphthalene-derived compounds

圖5 草莓空白樣品色譜圖Fig.5 Chromatogram of the blank strawberry sample

圖6 草莓加標樣品色譜圖(0.01 mg/kg)Fig.6 Chromatogram of the spiked strawberry sample(0.01 mg/kg)

2.3 線性范圍、檢出限和定量限

經超高效液相色譜儀測定,3種化合物在0.005～1.0 mg/L濃度范圍內與色譜峰面積呈現良好的線性關系,相關系數(r)>0.9999。通過加標回收實驗,根據信噪比(S/N)≥3的峰響應值和樣品前處理的稀釋倍數,確定方法檢出限(LOD)為0.002～0.003 mg/kg,根據信噪比(S/N)≥10的峰響應值和樣品前處理的稀釋倍數,確定方法定量限(LOD)為0.006～0.01 mg/kg。3種萘衍生物的回歸方程、相關系數、檢出限和定量限見表1。

表1 回歸方程、相關系數(r)、檢出限(LOD)和定量限(LOQ)Table 1 Regression equations,r,LODs and LOQs

2.4 方法的準確度與精密度

對草莓、蘋果和柑橘等空白樣品進行添加回收實驗,添加水平為0.01、0.1和1.0 mg/kg,考察方法的準確度和精密度,回收率和相對標準偏差(RSDs)結果見表2。結果顯示,3種萘衍生物在水果中的添加回收率為78.3%～95.3%,RSD為2.8%～9.5%,準確度與精密度能滿足殘留檢測要求。

表2 添加回收率和相對標準偏差(RSD)(n=6)Table 2 Spiked recoveries and RSDs(n=6)

2.5 實際樣品測定

用該方法分別對購買的草莓、蘋果、柑橘、葡萄、荔枝5種水果共25個樣品進行檢測,結果均未檢出有NAD、NAA和2-NOA殘留。

3 結論

采用QuEChERS法凈化,建立了超高效液相色譜-熒光法同時測定水果中1-萘乙酰胺、1-萘乙酸和2-萘氧乙酸的分析方法。該法測定水果中3種萘衍生物NAD、NAA和2-NOA,檢出限可達0.002～0.003 mg/kg,比我國現有標準NAA的檢測方法GC法和GC-MS法檢出限更低。通過方法準確度和精密度實驗得到加標回收率為78.3%～95.3%,RSD為2.8%～9.5%,準確度與精密度均符合殘留分析要求,前處理操作簡單、快速,選擇性和靈敏度均優于HPLC-UV法,易于推廣應用。