QuEchERs高效液相色譜柱后衍生法測定茶葉中10種氨基甲酸酯類農藥殘留

王曉亮,毛衛中,汪新華,樓春蘭,吳 飛,陸君羚,周 璇

(開化縣檢驗檢測研究院,浙江開化 324300)

茶葉是我國重要的出口經濟作物之一。日本和歐盟是我國茶葉的兩大出口地,對于茶葉中的農藥殘留有著嚴格的限量標準[1-2],農藥殘留業已成為我國茶葉出口的瓶頸。

QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged,safe的簡稱)前處理方法是近年來國際上新發展起來的一種樣品前處理方法,具有快速、簡單、廉價、高效、可靠、安全的優點。目前已經有文獻報道QuEChERS方法的應用,除被廣泛應用于水果和蔬菜等樣品中的農殘檢測外[3-5],還被應用于油脂類[6]、糧谷類[7]、土壤[8]、中藥材[9]、動物源食品[10]等樣品中農殘檢測。

氨基甲酸酯類農藥是一類高效、廣譜殺蟲劑,它是一類以甲酸酯為前體化合物發展而來的農藥[11],主要應用在糧食、蔬菜和水果上。目前QuEChERS方法雖然應用廣泛,但是應用于茶葉中的氨基甲酸酯檢測結合高效液相色譜-柱后衍生熒光法還未見報道,本文著眼于此點開發了此方法,可以對以后的實驗者有一定借鑒作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶葉樣品 開化龍頂,2016年4月茶葉監督抽檢樣品,一芽一葉,粉碎備用;涕滅威亞砜、涕滅威砜、滅多威、三羥基克百威、涕滅威、速滅威、克百威、甲萘威、異丙威、仲丁威標準品 濃度100 μg/mL,農業部環境保護科研監測所;甲醇、乙腈 色譜純,TEDIA公司;乙酸、無水乙酸鈉 分析純,天津科密歐化學試劑有限公司;無水硫酸鎂 分析純,天津致遠化學試劑有限公司;N-丙基乙二胺(PSA)粉末 艾杰爾科技公司;實驗用水 超純水;柱后衍生試劑套裝 鄰苯二甲醛(OPA)稀釋溶液,貨號CB910、水解試劑,貨號CB310、鄰苯二甲醛(OPA),貨號0120、巰基乙醇,貨號3700-2000,美國Pickering公司。

Waters e2695高效液相色譜儀 配Waters 2475熒光檢測器和柱后衍生裝置,美國Waters公司;AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;HN200氮吹儀 山東海能科學儀器有限公司;Vortex-BE1漩渦混合器 海門其林貝爾儀器制造有限公司;微孔濾膜(0.22 μm) 島津公司;UPT-I-20T超純水機 上海優普實業有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液配制 準確吸取10種農藥標準溶液(濃度100 μg/mL)100 μL置于進樣小瓶中,配制成10 μg/mL的農藥混合標準儲備溶液。用甲醇將10 μg/mL的農藥混合標準儲備溶液稀釋成1.0 μg/mL的農藥混合標準工作溶液,然后根據需要用甲醇配制成適當濃度。

1.2.2 柱后衍生試劑的配制 先傾倒5 mL鄰苯二甲醛(OPA)稀釋溶液于干凈小燒杯中用于溶解巰基乙醇,稱取100 mg OPA于干凈小燒杯中,傾倒10 mL色譜純甲醇溶解,待完全溶解后傾倒入OPA稀釋溶液中,稱取2 g巰基乙醇倒入裝有OPA稀釋溶液的小燒杯中,溶解完畢后傾倒入OPA稀釋溶液中。

1.2.3 樣品提取和凈化 精確稱取2.00 g茶葉粉末,加入10.0 mL 0.1%醋酸乙腈提取液,振蕩,超聲提取10 min加入1.0 g無水硫酸鎂,1.0 g無水乙酸鈉,渦旋振蕩30 s后,4000 r/min離心5 min,吸取5 mL上清液于15 mL已加入1.5 g無水硫酸鎂、150 mg PSA粉末的離心管中,輕搖振蕩,4000 r/min離心5 min,吸取1 mL上清液于15 mL離心管中,氮氣吹干,用1 mL乙腈水(1+1)復溶,過0.22 μm濾膜后供液相色譜分析。

1.2.4 實驗條件

1.2.4.1 液相色譜條件 Waters公司氨基甲酸酯農藥分析色譜柱(150 mm×3.9 mm,粒徑5 μm);柱溫42 ℃;進樣體積10 μL。液相色譜洗脫條件見表1。

表1 流動相組成及梯度洗脫程序Table 1 The mobile phase and gradient eluted program

1.2.4.2 柱后反應單元及試劑管理單元的設定 柱后反應單元溫度:80 ℃;試劑管理單元流速:水解試劑:0.3 mL/min;鄰苯二甲醛/巰基乙醇溶液:0.3 mL/min。

1.2.4.3 Waters 2475熒光檢測器的設定 激發波長:339 nm,發射波長:445 nm,采集點數:10點/s。

1.3 數據統計分析

利用EXCEL 2010統計分析軟件進行數據整理分析,利用Origin 8.5作圖。

2 結果與分析

2.1 提取與凈化條件的優化

2.1.1 提取條件的優化 茶葉中農殘檢測樣品取樣量和蔬菜水果中的農殘檢測樣品取樣量差別較大,因為茶葉樣品本身含有的干擾物質較多,較大取樣量會增大基質中的干擾,相關文獻報道過茶葉中農殘檢測的取樣量為2 g或5 g[12-13],因此為了降低干擾,取樣量要適度降低,故本方法采用的取樣量為2 g。

在提取前是否加水浸泡及提取液的體積選擇方面,王翔等[14]詳細研究了加水浸泡對于干茶葉中農殘提取的影響,發現加水浸泡反而降低了茶葉中農殘的提取率。因此本實驗提取前不加水。

對于提取液的體積選擇方面,查閱相關文獻報道,陳磊等[15]詳細研究了利用乙腈并采用不同料液比對于提取茶葉中氨基甲酸酯類農殘的影響,結果表明料液比為1∶5時回收率最優。陳磊等人所采用的提取過程與本文方法一致,同為提取前不加水浸泡并且提取溶劑也同為乙腈,所以本方法的乙腈提取液體積為10 mL。

無水硫酸鎂在提取過程中起到結合提取液中的水分的作用,考慮到茶葉為水分較少的樣品,1 g無水硫酸鎂結合水后為七水硫酸鎂,理論上能夠結合1.05 g水,所以2 g茶葉樣品中加入1 g無水硫酸鎂能夠除去多余水分。

2.1.2 N-丙基乙二胺(PSA)凈化填料的用量 實驗證明,PSA凈化填料的加入能夠顯著除去茶葉中的脂肪酸、糖類和一些色素等干擾物質,使提取液得到有效凈化。PSA的加入能夠去除茶葉中的干擾物質,同時也會在一定程度上吸附目標農藥,降低回收率[16]。因此,在實驗中需要綜合考慮凈化填料的使用量。分別實驗了添加150、300、500 mg PSA凈化填料的農藥回收率,結果顯示添加150 mg PSA和300 mg PSA的農藥平均回收率分別為88.77%和86.34%,都符合GB/T 27404-2008中關于回收率在80%～110%之間的技術要求,而添加500 mg PSA的農藥平均回收率為78.84%,并不符合相關要求。考慮回收率和成本的因素,因此本實驗選用150 mg PSA作為凈化填料的添加量。

2.2 相關性實驗

吸取十種氨基甲酸酯農藥混合標準工作液(1.0 μg/mL)適量,用甲醇稀釋成濃度為0.01、0.05、0.10、0.20、0.50 μg/mL的標準系列,分別吸取10 μL標準混合溶液和凈化后的樣品溶液注入液相色譜儀中,以保留時間定性,以峰面積定量。其色譜圖分別見圖1和圖2。上述十種氨基甲酸酯農藥在0.01～0.50 μg/mL濃度范圍內呈良好的線性,相關系數均達到0.9996以上。結果見表2。

表2 10種氨基甲酸酯農藥回歸方程、相關系數、線性范圍及檢出限和定量限Table 2 Linear equations,correlation coefficients(R2),linear rangs,detection limits and quantization limits of 10 carbamates pesticide

圖1 10種氨基甲酸酯農藥標準色譜圖(500 ng/mL)Fig.1 Standard chromatography of 10 carbamate pesticides(500 ng/mL)

2.3 檢出限(LOD)和定量限(LOQ)

在陰性茶葉樣品中分別添加涕滅威亞砜、涕滅威砜和滅多威0.02 mg/kg做檢出限測定,添加0.05 mg/kg做定量限測定;分別添加三羥基克百威、涕滅威、速滅威、克百威、甲萘威、異丙威和仲丁威0.01 mg/kg做檢出限測定,又添加0.05 mg/kg做定量限測定,以S/N(信噪比)=3的濃度為檢出限,以S/N(信噪比)=10的濃度為定量限,結果見表2。

2.4 回收率與精密度實驗

用十種氨基甲酸酯農殘為陰性的茶葉樣品進行加標回收實驗,對樣品進行0.1、0.25、0.5 mg/kg三個水平的添加,每個水平平行測定6次,結果見表3,測得平均回收率為81.98%～95.59%,相對標準偏差(RSD)為1.22%～4.98%,說明該方法重現性好,精密度高,達到分析要求。

表3 10種氨基甲酸酯農藥回收率(n=6)Table 3 Recoveries of 10 carbamate pesticides

3 結論

本文建立了Quechers前處理-高效液相色譜柱后衍生熒光法檢測茶葉中10中氨基甲酸酯農藥殘留的方法。相對于傳統的氨基柱凈化方法,本方法簡便、高效,通過提取凈化條件的優化,梯度洗脫分離,10種氨基甲酸酯農藥在24 min內能夠達到較好分離。方法學結果表明該方法的回收率高,重復性好,精密度高,適合于茶葉中的氨基甲酸酯農藥殘留分析測定。