環磷酸腺苷顆粒劑的制備

張義軍,撒玉良,陳 文,*

(1.石河子大學醫學院第一附屬醫院藥劑科，新疆石河子 832000;2.石河子大學藥學院，新疆石河子 832000)

紅棗(Zizyphusjujubadates),是鼠李科棗屬植物棗樹的果實,原產于我國,栽培歷史悠久,在中國,紅棗的栽培面積及產量占世界產量的90%以上。但是我國紅棗產業存在產品單一,技術含量較低及生產規模不夠大等問題。新疆所產的紅棗由于其擁有日照時間長,晝夜溫差大等特殊的自然條件,所產紅棗中的營養成分更是豐富。紅棗中的主要營養成分有蛋白質、天冬氨酸、谷氨酸等多種氨基酸，維生素A、維生素B及環磷酸腺苷(cAMP)等[1],糖類主要是多糖以及水溶性糖等。

紅棗中各種活性成分最為突出的則是cAMP,它是重要的生命物質,相關研究證實,包括癌癥、高血壓、心肌梗死及冠心病等多種疾病[2-3]的發生都與cAMP的代謝有關,cAMP是核苷酸的衍生物,由腺嘌呤、核糖和磷酸組成,磷酸與核糖的3′,5′位相連成環狀,由此稱為環磷酸腺苷,它是蛋白激酶的致活劑,是一種具有生理活性的重要物質,作為生命信息傳遞的第二信使,能參與細胞分裂與分化、形態形成、類固醇生成、糖原和脂肪分解等多種生理生化過程,在基因表達中發揮至關重要的作用,能抑制細胞增殖、癌細胞、過敏性疾病等,對神經系統也有調節作用,還能誘導激素或酶的合成,促進機體合成代謝[4]。cAMP的合成方法較多,有化學合成法、微生物發酵法以及從天然產物中提取(包括水浴提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法等)[5-7],但是合成法與微生物發酵法成本較高,而且產率較低,故從天然產物中提取是獲得cAMP比較重要的途徑。有數據表明,紅棗中cAMP的含量高達100～600 nmoL/g,其含量是已經測定的180中動植物種最高的一種,是制備cAMP的最佳植物[8]。目前cAMP臨床使用的產品主要是其注射劑,但在用藥依從性等方面存在著問題,本研究通過對已報道的cAMP提取方法進行選擇及優化,將獲得的cAMP制備成為用藥依從性較好的顆粒劑,不僅解決cAMP用藥依從性差的問題,而且有攜帶方便等諸多優點。

本實驗以和田紅棗為研究目標,采用響應面實驗設計方法進行cAMP提取工藝的優化,通過正交實驗設計優化顆粒劑最佳輔料配比,采用HPLC法進行含量分析,為新疆紅棗產業多元化,商品多元化及對cAMP的充分利用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新疆和田紅棗 2016年10月采摘,去核,在40 ℃下干燥,粉碎后粉末過40目篩,室溫保存;cAMP標準品 純度98%，北京索萊寶科技有限公司;甲醇 色譜醇，國藥集團化學試劑有限公司;無水乙醇 分析純，天津市富宇精細化工有限公司;乳糖 分析純，天津市福晨化學試劑廠;可溶性淀粉 分析純，天津市盛奧化學試劑有限公司;糊精 分析純，天津市盛奧化學試劑有限公司;蒸餾水 實驗室自制。

AL204電子分析天平 奧豪斯國際貿易(上海)有限公司;島津高效液相色譜儀 島津企業(管理)有限公司;WD800-微波爐 樂金電子(天津)電氣有限公司;KQ-500DE型數控超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司;DHG-9240電熱恒溫鼓風干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司;TDL-5型低速大容量離心機 上海安亭科學儀器廠;

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理 將紅棗清洗后去核,粉碎,過40目篩,備用。

1.2.2 提取方法選擇 參考文獻[9-11],對水浴提取法、微波輔助提取法和超聲波輔助提取法三種方法進行比對。

水浴提取法:準確稱取50.000 g棗粉,加入100 mL蒸餾水,于室溫下浸泡12 h。經過浸泡后將其加熱至約60 ℃,然后經打漿機打漿1 h,抽濾,再將其棗渣同上述操作重復一次,合并濾液,得cAMP提取液,在50 ℃條件下減壓濃縮,濃縮至50 mL,取濃縮液2 mL置于50 mL的容量瓶,用蒸餾水稀釋至刻度,用0.45 μm濾膜過濾,進行HPLC測定。

微波輔助提取法:準確稱取棗粉2.000 g,以料液比1∶30溶解于體積分數10%的乙醇溶液常溫浸泡6 h,300 W微波功率處理3 min,所得溶液在3000 r/min下離心5 min,上清液即cAMP提取液,經抽濾、在60 ℃下真空濃縮后,用雙蒸水在50 mL的容量瓶中定容,過0.45 μm濾膜,進行HPLC測定。

超聲輔助提取法:準確稱取棗粉4.000 g,放入錐形瓶中,加入體積分數為15%的乙醇,按料液比1∶20,超聲功率75 W,超聲溫度40 ℃,超聲時間15 min進行超聲波輔助萃取,超聲萃取后取出放入40 ℃的水浴中繼續提取8 h,以轉速3000 r/min離心5 min,取上清液置入100 mL濃縮瓶中,殘渣再加體積分數為15% 的乙醇溶液10 mL,同條件再次離心,合并上清液,所得上清液經真空濃縮后轉入50 mL的容量瓶中,最后用pH為3(用體積分數為10%的乙酸調節pH達酸性條件)的雙蒸水定容至刻度。取上述稀釋液25 mL再稀釋一倍,所得稀釋液過0.45 μm濾膜,進行HPLC測定。

1.2.3 環磷酸腺苷含量測定方法 色譜條件與系統適用性實驗:用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑,以0.2%的甲酸溶液-甲醇(80∶20)為流動相,檢測波長為259 nm。取cAMP對照品約10.0 mg,加雙蒸水5 mL使溶解,加稀鹽酸溶液與氫氧化鈉溶液調pH至中性,用雙蒸水稀釋成0.1 mg/mL的溶液,取20 μL注入液相色譜儀,調整色譜系統,環磷酸腺苷峰與相鄰雜峰的分離度應符合要求。理論塔板數按環磷酸腺苷計算不低于2000,拖尾因子應小于1.4。

取適量環磷酸腺苷提取液,稀釋至一定濃度,作為供試液,精密量取20 μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖;另取環磷酸腺苷對照品適量,同法測定,按外標法以峰面積計算,即得cAMP含量。

cAMP標準工作曲線繪制:準確稱取一定質量的cAMP標準品,置于10 mL的容量瓶中,用去離子水稀釋成濃度為5.8、17.4、29、40.6、52.2 μg/mL的標準溶液,取配制的標準溶液20 μL,注入高效液相色譜儀,記錄色譜圖中峰面積,以標準品濃度(μg/mL)為橫坐標,峰面積(即mAU)為縱坐標,繪制標準曲線。

1.2.4 響應面法優化最佳提取工藝 在前期實驗基礎上,選用微波輔助提取法作為 cAMP的提取方法,以cAMP的提取率為指標。根據BOX-Behnken中心組合實驗設計原理,應用Design-Expert-8.0.6軟件,選取料液比(A),提取時間(B),微波功率(C),乙醇體積分數(D),微波處理時間(E)5個因素,每個因素進行三水平實驗,分別以-1、0、1進行編碼,以cAMP的提取率為響應面響應值,實驗因素水平設計見表1。

表1 響應面分析因素與水平Table 1 Variables and levels in response surface design

cAMP提取率(%)=提取液濃度×提取液體積÷棗粉質量

1.2.5 環磷酸腺苷顆粒劑的制備

1.2.5.1 輔料的篩選 稱取浸膏5.000 g,分別取可溶性淀粉、乳糖、糊精以及這三種輔料以質量比1∶1混合后的混合輔料各20.000 g,將輔料與浸膏混合,以體積分數為75%的乙醇為潤濕劑,用手指不斷的搓捏,混合均勻,以“手握成團,輕壓即散”作為制軟材的標準,在16目篩上制粒,制得的顆粒放入烘箱,55 ℃下,干燥3 h。

1.2.5.2 輔料篩選指標確定 通過測定輔料與浸膏混合均勻后制備的顆粒的成型性、堆密度、休止角、溶化率以及吸濕性等指標,并以成型性分值、堆密度分值、休止角分值、溶化率分值以及吸濕性分值來評選出最優的輔料[12]。

綜合指標=成型性分值(15)+堆密度分值(15)+休止角分值(15)+溶化率分值(20)+吸濕性分值(35)。

上述5項檢測結果進行綜合評分,對比每個輔料所積的分數,分值最高的即為顆粒劑最佳輔料。

成型性測定:對所制備的顆粒精確稱重,先過1號篩,再過5號篩進行整粒,通過1號篩而不過5號篩的顆粒進行稱重,按公式計算顆粒劑成型率及成型性分值。

成型率(%)=過篩后的顆粒質量/過篩前的顆粒質量×100。

成型性分值=(15/最大成型性值)×成型性值。

堆密度檢測:將過篩整粒后的顆粒稱重后放入干燥的量筒中,輕輕震搖后讀取刻度(V)mL,并記錄質量(M)g,堆密度值及堆密度分值計算公式如下:

堆密度值=M/V;

堆密度分值=(15/最大堆密度值)×堆密度值

休止角的檢測:采用固定漏斗法,將3只漏斗串聯并固定在水平的坐標紙上1～2 cm的高度,將顆粒從最上面的漏斗壁慢慢加入,直到顆粒在坐標紙上形成一個圓錐體,圓錐體的頂端與最下面的漏斗口為止,由坐標紙測出圓錐的直徑(2R),并測出圓錐體的高度(H),計算出休止角tga=H/R,重復測定5次,計算出平均值。

休止角分值的運算公式:

休止角分值=(最小休止角值×15)/休止角值

溶化率檢測:精密稱取干燥顆粒0.5000 g,加入10 mL的干燥恒重的離心管中,加入沸水5 mL,振蕩5 min,在3000 r/min下離心15 min,棄上清液,在80 ℃下將殘渣烘干至恒重,精密稱定,計算溶化率及溶化率分值。

溶化率(%)=溶化的顆粒質量/顆粒總重量×100

溶化率分值=(20/最大溶化率)×溶化率值

吸濕性檢測:精密稱取按1.3.1中制備的6種顆粒劑放入稱量瓶中,平鋪厚度約為2 mm,然后放入底部裝有NaCl飽和溶液的干燥器中(相對濕度為75%),48 h后取出,精密稱定。按照如下方式計算吸濕率:

吸濕率(%)=(吸濕后的質量-吸濕前的質量)/稀釋前的質量

吸濕率分值=(最小吸濕率×35)/最大吸濕率

1.2.6 正交法優化成型工藝

選擇浸膏與乳糖(輔料)比例、乙醇體積分數、干燥溫度作為考察因素,以成型性作為評價指標,用L9(34)正交表安排實驗,見表2。

表2 L9(34)正交表Table 2 L9(34) Orthographic table

1.2.7 質量控制

1.2.7.1 性狀鑒別 顆粒劑外觀從顏色、氣味與外觀形狀驚醒觀察,取3批顆粒劑樣品,分別編號1、2、3進行鑒別,顆粒劑應干燥、均勻、色澤一致、無潮濕、軟化、結塊、潮解等現象。

1.2.7.2 溶化性檢查 按照《中國藥典》2010版中關于溶化性檢查方法,精密稱取3份顆粒劑10.000 g,加熱水200 mL,進行溶化性檢查。

1.2.7.3 粒度檢查 按照《中國藥典》2010版附錄中的雙分法進行測定。

1.2.7.4 干燥失重 取3批顆粒劑各一定質量,在105 ℃干燥至恒重,含糖顆粒應在80 ℃,減失重量不得超過2.0%。

1.2.7.5 微生物限度 依據2010版《中華人民共和國藥典》一部附錄XIII C項下方法檢查。

1.2.7.6 顆粒劑含量測定 取3份不同批次的顆粒劑樣品各1.000 g,于10 mL的容量瓶中溶解并稀釋至刻度,精密吸取20 μL,在上述色譜條件下進行含量測定。

1.3 數據處理

數據處理采用Excel 2010處理,結果取3次重復的平均值。使用Design-Expert-8.0.6軟件的數據處理系統,完成數學回歸模型的建立、顯著性分析、響應曲面分析[13]。

2 結果與分析

2.1 含量測定方法

按照1.2.1項下方法以縱坐標為峰面積,橫坐標為cAMP的量,繪制標準曲線,得cAMP回歸曲線為Y=19864X-27656,r=0.9991,表明cAMP進樣在5.8～52.2 μg/mL濃度間線性關系良好。cAMP標準品圖譜如圖1,樣品圖譜如圖2。

圖1 cAMP標準品HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of cAMP standard

圖2 樣品溶液HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of Sample solution

2.2 提取方法選擇

以cAMP提取率為實驗方法選擇依據,方法選擇結果見表3。

表3 提取方法的選擇Table 3 Selection of extraction methods

由表3可知,這三種提取方法中微波輔助提取法的產率最高,同時考慮到水浴法操作步驟繁瑣,因此選擇微波輔助提取法為cAMP的提取方法。

2.3 響應面實驗設計及結果

以cAMP的提取率為響應值(Y)進行優化,結果見表4。

表4 響應面分析結果Table 4 Response surface analysis results

2.4 響應面結果分析

應用Design-Expert.v.8.0.6版軟件對實驗所得數據進行響應面分析,對各單因素進行多元線性回歸,得到模擬回歸方程:cAMP提取率(%)=28.46-0.49A-0.22B+0.15C-0.053D+0.50E-0.83AB-0.58AC-1.40AD-0.23AE-1.16BC-0.42BD+0.48BE-0.61CD-0.23CE+0.88DE-1.42A2-1.87B2-1.48C2-0.53D2-0.42E2,響應面回歸顯著性方差分析見表5。

表5 cAMP提取率響應面結果的方差分析Table 5 ANOVA analysis of cAMP extraction rate response surface results

從表5可知,該模型具有高度顯著性(p<0.05),失擬項不顯著,同時模型相關系數R2=0.9123,大于0.9,模型相關度較好。其響應值的變化有91.23%與所選變量有關,由表5可知,各因素對cAMP的提取率影響的主次順序為:D>A>E>B>C,由于該模型相關性很好,所以可以利用該模型進行分析預測最佳工藝。

2.4.1 工藝優化與預測 根據響應面實驗設計結果運用Design-Expert.v 8.0.6軟件繪制響應值與其中任意兩個因素的三維效應面曲線圖,響應曲面的陡峭程度,曲面越陡峭,顯著程度越高,陡峭程度越小,則表示交互作用顯著程度越低。各因素之間交互影響直觀效果如圖3(a)～(j)圖所示為當料液比(A)、提取時間(B)、微波功率(C)、乙醇體積分數(D)、以及微波處理時間(E)中任意三個因素為零水平時,其余兩個因素交互作用對cAMP提取率的影響[14]。

由響應面圖(圖3)及p值的分析可得,兩兩因素間對響應值均有一定的交互作用,其中料液比-提取時間、料液比-微波功率、料液比-乙醇體積分數、料液比-微波處理時間、提取時間-乙醇體積分數、提取時時間-微波處理時間、微波功率-乙醇體積分數、微波功率-微波處理時間以及乙醇體積分數-微波處理時間交互作用不顯著,提取時間-微波功率的交互作用對cAMP提取率影響較為顯著(p<0.05)。

為了進一步確證最優工藝條件,對回歸方程取一階偏導等于零,得到曲面最大點,求導方程最后得出各個因素最優條件為:料液比1∶14.55 (g/mL),提取時間7.5 h,微波功率270 W,乙醇體積分數為30%,微波處理時間10 min,在此條件下,cAMP理論提取率403.6 μg/g。

2.4.2 驗證實驗 為驗證模型的可行性,在模型預測的基礎上,在料液比1∶15 (g/mL),提取時間7.5 h,微波功率270 W、乙醇體積分數為30%、微波處理時間10 min的條件下重復6次實驗,取平均值,得到cAMP提取率為387.8 μg/g,實際提取率與理論已提取率的吻合度為96.1%,表明采用響應面法得到的最優提取條件各參數可靠。

2.5 顆粒劑優化結果

2.5.1 輔料篩選結果 對所選輔料進行綜合評分,由表6可知,乳糖的評分最高(97.19),可溶性淀粉含量最低,因此選用乳糖作為cAMP顆粒劑的最優輔料。

表6 綜合評分Table 6 Comprehensive score

2.5.2 正交設計實驗結果 每份取浸膏5.000 g,按照表3確定的浸膏與輔料的比例以及稀釋劑乙醇體積分數進行混合制軟材,通過16目篩制粒,按表3所確定的干燥溫度下進行干燥,然后測定能通過1號篩且不能通過5號篩的顆粒重量,以成型性作為考察指標,進行正交實驗,并對結果進行分析,見表7、表8。

表 7 L9(34)正交實驗設計及測定結果Table 7 L9(34)orthogonal test design and determination results

表8 方差分析表Table 8 Analysis of variance table

由表7分析可知,由極差R可知,對成型率影響因素大小依次為浸膏與輔料配比、干燥溫度與乙醇體積分數。表8的方差分析表明,輔料與浸膏比例對成型性有顯著影響(p<0.05)。

以cAMP顆粒劑成型率為評價指標,最佳制粒工藝條件為A2B2C2,即浸膏與輔料配比1∶4,乙醇體積分數為75%,干燥溫度50 ℃。根據最佳工藝條件A2B2C2制備3批顆粒劑并進行合格率測定,成型率分別為97.2%、96.9%、96.1%,平均成型率為96.73%,符合《中國藥典》2015版中對顆粒劑粒度的要求,雖然其成型率小于正交實驗中的第6、7組實驗結果,但是考慮到顆粒劑粒度均一性,前者較后兩者的均勻,第6、7組實驗所得顆粒均勻性較差,因此選擇A2B2C2為最佳制備條件。符合《中國藥典》2015版中對顆粒劑粒度的要求。

2.6 顆粒劑質量檢查結果

2.6.1 性狀檢查 本品為顆粒劑,通過多批樣品屬性檢查,均為棕黃色顆粒,味微甜,顆粒均勻,色澤一致,無吸潮、軟化現象

2.6.2 粒度檢查 按照《中國藥典》2010版附錄記載的合格率檢查方法,雙分法進行測定。能通過1號篩而不能通過5號篩的顆粒為合格顆粒,計算合格顆粒收率為95.8%,符合要求。

2.6.3 溶化性檢查 按照1.5.2項下方法測定。顆粒劑在30 s內全部溶解,溶液為棕紅色澄清液體,符合《中國藥典》2010版的要求。

2.6.4 干燥失重 按1.5.4項下方法測定。稱取3批顆粒劑質量為2.0021、2.0092、2.0056 g,其在105 ℃下干燥至恒重,失重百分比為1.3%、1.24%、1.28%,均小于2%,所以符合《中國藥典》2010版要求。

2.6.5 微生物檢查 依據 《中華人民共和國藥典》2010版一部附錄XIII C項下方法檢驗,3批cAMP顆粒劑每1 g含需氧菌為700 cfu/g,符合 《中華人民共和國藥典》顆粒劑項下要求。

2.6.6 顆粒劑含量測定 取環磷酸腺苷顆粒劑3批樣品(20170715,20170718,20170721),按上述色譜條件進行含量測定,得顆粒劑平均含量為156.2 μg/g。cAMP顆粒劑每袋(10 g)cAMP含量不得少于1.5 mg,因此本品符合質量要求。

3 結論

本實驗以新疆紅棗為原料,選取料液比、提取時間、乙醇體積分數、微波功率與微波處理時間為自變量,cAMP提取率為響應值,利用響應面分析,建立微波提取新疆紅棗中cAMP的工藝模型。由回歸分析表明,該模型穩定性好,通過顯著性分析得到各因素的主效應關系為:乙醇體積分數>料液比>微波處理時間>微波頻率>提取時間。研究結果還表明,新疆紅棗落地棗cAMP微波提取最佳工藝參數為:料液比1∶15、提取時間7.5 h,微波功率270 W,乙醇含量30%,微波處理時間10 min。cAMP理論提取率為403.6 μg/g,實際提取率為387.8 μg/g,兩者吻合度達到96.1%。

實驗采用綜合評分的方法對cAMP顆粒劑的幾種輔料乳糖、可溶性淀粉、糊精以及其混合輔料進行選擇,最終選擇乳糖作為cAMP顆粒劑的輔料,通過正交實驗設計選擇出最優的輔料配比,以浸膏:乳糖比為1∶4、乙醇體積分數為75%、干燥溫度為55 ℃為最優的制備方案,所制得顆粒劑在粒度、溶化率、吸濕性等方面均符合藥典要求。因此,本實驗的提取方法以及顆粒劑的輔料選擇是正確的,適用于cAMP顆粒劑的制備。