響應面法優化大白菜腌制條件

褚路路,楊麗聰,鄭國棟

(江西農業大學江西省天然產物與功能食品重點實驗室,江西南昌 330045)

眾所周知,蔬菜中富含豐富的維生素、礦物質、纖維素等人體不可缺少的營養成分,是人類餐桌上必不可少的一種食物。伴隨而來是多種蔬菜加工方式的出現,其中,蔬菜腌制是中國應用最普遍、最古老的蔬菜加工方法,是一種將新鮮蔬菜經預處理后,利用高濃度鹽液、乳酸菌發酵來保藏蔬菜,并通過腌制增進蔬菜風味以賦予其新鮮滋味的方法[1],發酵蔬菜、泡菜、榨菜等都屬于腌制蔬菜的范疇。

蔬菜在生長過程中易富集硝酸鹽,在腌制過程中,腌制蔬菜易被雜菌污染,如果加入食鹽量少于10%,蔬菜中的硝酸鹽極易被微生物還原成亞硝酸鹽[2-4]。隨著腌制時間的增加,腌制蔬菜中亞硝酸鹽的含量不斷增加,一周后可達到高峰,甚至可持續2～3周,20 d后亞硝酸鹽含量會逐漸下降,達到安全食用標準。亞硝酸鹽毒性較強,人體食用0.2～0.5 g亞硝酸鹽或硝酸鹽就會引起中毒[5-6],使血液中正常攜氧的低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白,失去攜氧能力而引起組織局部缺氧造成缺氧損傷。硝酸鹽不但可導致高鐵血紅蛋白癥,還會與食物中的蛋白質發生反應而生成強致癌物質—亞硝胺。亞硝酸鹽與胺類或酰胺類同時存在,孕婦過量攝入可能造成胎兒致癌、畸形、甚至死亡[7]。因此腌制蔬菜中亞硝酸鹽含量測定是食品衛生檢驗的必測項目之一。

傳統腌制方法只能通過規范腌制天數來和接種發酵[8]來降低亞硝酸鹽的含量,本實驗綜合考慮發酵條件和添加物[9]對腌制大白菜中亞硝酸鹽含量生成的影響。本文以腌制大白菜中亞硝酸鹽的含量變化動態過程為實驗基礎,采用國標法(GB/T 5009.33)—鹽酸萘乙二胺法,探究了維生素C加入量、食用醋酸加入量、腌制時間三個因素對腌制大白菜中亞硝酸鹽含量的影響,通過響應面優化尋求最佳的腌制條件和輔料比例,旨在減輕腌制菜中亞硝酸鹽含量過高對食用者的威脅,同時為更深入探究其它腌制菜中的亞硝酸鹽含量提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料大白菜(生長在南昌郊區蔬菜基地,品種為超級白菜,青白幫,花心直筒型,)、食鹽等 南昌批發超市;食用醋酸(含量≥99.5%) 濟南鴻橋化工有限公司;維生素C、活性炭、飽和硼砂溶液、乙酸鋅、格氏粉劑 天津風船化學試劑科技有限公司;亞鐵氰化鉀、亞硝酸鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺 國藥集團化學試劑有限公司;以上所有化學試劑均為分析純。

TU-1900雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;YP202電子天平 上海富雪生物科技有限公司;GPX-9248A保溫箱 上海躍進醫療器械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 腌制方法 取200 g清洗后的大白菜,切碎后放入腌制壇中,在加入10%食鹽的基礎上,分別加入不同濃度的維生素C和食用醋酸,并攪拌均勻,最后封壇,在25 ℃條件下腌制30 d。

1.2.2 腌制過程亞硝酸鹽含量的變化 取200 g處理干凈的大白菜,加入食鹽10%,作為空白對照組在25 ℃條件下進行腌制,分別測定第2、4、6、8、10、15、20、25、30 d時測腌制大白菜中的亞硝酸鹽含量。

1.2.3 亞硝酸鹽含量的測定

1.2.3.1 標準曲線的繪制 將亞硝酸鈉標準品溶液稀釋至10 mg/L,4 ℃保存備用。準確量取0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL的亞硝酸鈉標準品溶液(10 mg/L),加入2 mL對氨基苯磺酸溶液,混合均勻,靜置5 min再加入1 mL鹽酸萘乙二胺溶液,加水稀釋至50 mL,混勻,靜置15 min,樣品液通過分光光度計在波長538 nm處測定吸光度值,以亞硝酸鈉含量為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線[10-12]。

1.2.3.2 腌制大白菜中亞硝酸鹽含量的測定 取一定量的腌制大白菜切成小塊,混勻,稱取200 g,將試樣置于榨汁機內,加蒸餾水200 mL,打成勻漿狀后全部移入 500 mL燒杯中備用。稱取勻漿40 g置50 mL燒杯中,用70 ℃的蒸餾水約150 mL分幾次將其沖洗入250 mL容量瓶中,加入6 mL飽和硼砂溶液并搖勻,加入2 g活性炭脫色,然后再加入2 mL乙酸鋅溶液和2 mL亞鐵氰化鉀溶液振搖4 min,以沉淀蛋白質。加水稀釋至刻度,搖勻,用真空泵過濾,濾液用于測定。吸取5.0 mL制備好的濾液于10 mL比色管中,加入 40 mg格氏粉劑,混勻,如未溶解可加熱使溶解,放置5 min后,于波長538 nm處測定吸光度,樣品每組平行測三次,記錄吸光值,帶入標準曲線中計算出腌制蔬菜中亞硝酸鹽的含量。

式中：X為試樣中亞硝酸鹽的含量,單位為毫克每千克(mg/kg);A為測定用樣液中亞硝酸鹽的質量,單位為微克(μg);M為試樣質量,單位為克(g);V2為測定用樣液體積,單位為毫升(mL);V1為試樣處理液總體積,單位為毫升(mL)。

1.2.4 單因素試驗

1.2.4.1 維生素濃度對腌菜中亞硝酸鹽的影響 取200 g處理干凈的大白菜,加入食鹽10%,食用醋酸10%進行腌制,腌制過程中加入不同量的維生素C 0、0.01%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%,25 ℃下在腌制25 d,測定亞硝酸鹽的含量,探究維生素C對亞硝酸鹽含量的影響。

1.2.4.2 食用醋酸濃度對腌菜中亞硝酸鹽的影響 取200 g處理干凈的大白菜,加入食鹽10%,維生素C 0.2%,腌制過程中加入不同量的食用醋酸0、4%、6%、8%、10%、12%、14%,25 ℃下在腌制25 d,測定亞硝酸鹽的含量,探究食用醋酸含量對亞硝酸鹽含量的影響。

1.2.4.3 溫度對腌菜中亞硝酸鹽的影響 取200 g處理干凈的大白菜,加入食鹽10%,維生素C 0.2%,食用醋酸10%,分別在20、25、30、35、40、50 ℃溫度條件下腌制25 d,測定亞硝酸鹽的含量,探究溫度對亞硝酸鹽含量的影響。

1.2.5 響應面實驗 通過對影響腌制大白菜中亞硝酸含量的三個因素:維生素C加入量、食用醋酸加入量、腌制時間進行單因素分析,采用Design-Expert.V8.0.6.1設計響應面實驗,因素水平見表1。

表1 腌制大白菜中亞硝酸鹽響應面實驗因素與水平編碼Table 1 Experimental factors and horizontal coding of nitrite response surface in pickled cabbage

1.3 數據處理

所有的實驗數據平行三次,結果表示為平均值±SD。數據用單因素方差分析進行分析,然后用SPSS 21(IBM software,NY,USA)進行Duncan’s檢驗。顯著水平設置為p<0.05。

2 結果與分析

2.1 亞硝酸鹽標準曲線

以吸光度為縱坐標,亞硝酸鹽(亞硝酸鈉)標準品濃度為橫坐標,作標準曲線如圖1,求得標準曲線的回歸方程為Y=0.8126X-0.074,R2=0.999,在(0～5.0) mg/mL范圍內線性關系良好。

圖1 亞硝酸鹽標準曲線Fig.1 The standard curve of nitrite

2.2 腌制過程亞硝酸鹽含量的變化

由圖2可以看出:在腌制第8 d亞硝酸鹽的含量達到頂峰,高于60.0 mg/kg,嚴重超出了國標規定(GB 2714-2015食品安全國家標準 醬腌菜)低于20.0 mg/kg的范圍。在第8 d之后,隨著時間的增加亞硝酸鹽的含量逐漸下降,在20 d時,亞硝酸鹽的含量為19.8 mg/kg低于國標20.0 mg/kg,并且之后含量也是逐漸降低的,在25 d下降到17.9 mg/kg,食用相對安全。隨著腌制天數的增加亞硝酸鹽含量先增加后降低,這與岳向冰[13]探究結果一致,只有保證足夠的腌制天數,才能確保亞硝酸鹽含量不超過國標。因此,接下來的單因素實驗均在腌制時間25 d后進行亞硝酸鹽的含量測定。

圖2 腌制天數對亞硝酸鹽的影響Fig.2 The effect of curing days on nitrite

2.3 單因素試驗對腌制大白菜中亞硝酸鹽含量影響

2.3.1 維生素C濃度對腌制大白菜中亞硝酸鹽含量影響 維生素C的加入量對腌制大白菜中亞硝酸鹽含量影響比較大。如圖3所示,由圖3可知,在腌制25 d時,亞硝酸鹽含量隨著維生素C添加量的增加而降低隨后趨于平穩,維生素C添加量在0.01%～0.20%下降,0.02%～0.25%趨于平緩,在0.20%后趨于穩定并出現最低值,其含量為15.1 mg/kg。因此,腌制過程中維生素C的最佳加入量為0.20%。本實驗結果與徐海斌[14]研究的腌制大頭菜亞硝酸鹽含量及降低措施研究的結果一致,維生素C、食用醋酸、溫度都會對腌制菜中亞硝酸鹽含量有影響。維生素C作為氧化劑,在腌制過程中可以有效的防止微生物對硝酸鹽的還原,使得亞硝酸鹽含量降低。食用醋酸的加入不僅可以調節腌制菜的風味口感,而且起到降低亞硝酸鹽含量的目的。因此,腌制過程中維生素C的最佳加入量為0.20%。

圖3 維生素C對腌制大白菜中亞硝酸鹽含量影響Fig.3 The effect of vitamin C on the content of nitrite in pickled cabbage

2.3.2 食用醋酸含量對腌制大白菜中亞硝酸鹽含量影響 食用醋酸的加入量對腌制大白菜中亞硝酸鹽含量影響如圖4所示,由圖4可知,亞硝酸鹽含量隨著食用醋酸添加量的增加總體呈現下降趨勢,當食用醋酸添加量在10%～12%時,亞硝酸鹽含量有一個小的上升波動過程,食用醋酸含量12%時,亞硝酸鹽含量16.5 mg/kg。食用醋酸含量增加到14%時,亞硝酸鹽含量降低到16.2 mg/kg,與食用醋酸添加量為10%時的亞硝酸鹽含量(16.3 mg/kg)相差很小。pH的降低會使微生物生長受限并且亞硝酸鹽在食用醋酸存在下可以分解[15],食用醋酸含量在10%之后亞硝酸鹽含量有升高趨勢,可能是因為過量的食用醋酸也抑制了乳酸菌,使得亞硝酸鹽含量升高?？紤]生產成本以及過量酸加入會影響口感,所以最適食用醋酸含量范圍8%～10%。

圖4 食用醋酸對腌制大白菜中亞硝酸鹽含量影響Fig.4 The effect of acetic acid on the content of nitrite in pickled cabbage

2.3.3 腌制溫度對腌制大白菜中亞硝酸鹽含量影響 溫度對腌制大白菜中亞硝酸鹽含量影響如圖5所示,由圖5可知,亞硝酸鹽含量在20～25 ℃隨著腌制溫度的增加降低,在25～35 ℃隨著溫度的增加而增加,35 ℃后降低,在35 ℃時最高為18.4 mg/kg。亞硝酸鹽含量隨著溫度的變化趨勢是由微生物決定的,溫度低于20 ℃時,微生物生長受到抑制,乳酸菌很大程度發酵收到抑制[16],同樣硝酸還原菌的活力也受到抑制。硝酸還原菌活力受到抑制,但是還原反應仍然在緩慢進行,所以低溫發酵只是延緩了亞硝酸鹽高峰值的到來,延長了腌制周期[17]。25～35 ℃隨著溫度的增加,亞硝酸鹽含量增加,亞硝酸鹽含量的高峰值到來比較早,可能因為在適宜的溫度范圍下有害微生物充分產生亞硝酸鹽,故在25～35 ℃下亞硝酸鹽含量升高,并且在35 ℃達到最大值。而35 ℃以后,過高的溫度抑制微生物生長,所以亞硝酸含量有所降低。為了縮短生產周期和減少成本并保證亞硝酸鹽含量較低,綜合考慮,最適腌制溫度范圍為20～30 ℃。

圖5 溫度對腌制大白菜中亞硝酸鹽含量影響Fig.5 The effect of temperature on the content of nitrite in pickled cabbage

2.4 響應面結果及數據分析

2.4.1 響應面實驗設計方案及結果 根據單因素實驗結果,采用Design-Expert.V8.0.6.1對腌制菜中亞硝酸鹽含量進行分析[15,18-20],結果見表2。

表2 響應面設計方案及結果Table 2 Response surface design scheme and results

2.4.2 方差分析及回歸方程擬合 采用Design-Expert.V8.0.6.1對數據進行分析,如表3所示。采用方差分析各因素對腌制大白菜中亞硝酸鹽含量的影響情況,該模型的F值為660.99,表明二次回歸方差具有顯著意義。p<0.0001,表明相關系數具有顯著水平,并且該模型適用于對腌制菜中亞硝酸鹽含量結果進行分析。由表3可知,各影響因素對腌制大白菜中亞硝酸鹽含量的主次順序為:食用醋酸含量>溫度>維生素C含量。

表3 亞硝酸鹽含量回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of nitrite content regression model

2.4.3 各因素交互影響 Design Expert.V8.0.6.1軟件處理而得的三維響應面圖用以闡述三個因素的交互作用和關系。三維響應面圖反映變量間的交互作用,圖6A為維生素C含量和食用醋酸含量對腌制菜中亞硝酸鹽含量的交互作用,當維生素C含量從0.15%增至0.23%、食用醋酸含量從8%升至11.37%,亞硝酸鹽含量顯著降低,維生素C超過0.23%和食用醋酸超過11.37%后,亞硝酸鹽含量趨于升高,并且維生素C和食用醋酸含量作用效果顯著(p<0.05)。但是維生素C和溫度以及溫度和食用醋酸的協同作用不顯著,如圖6B、圖6C。

圖6 兩兩因素交互作用對腌制大白菜中亞硝酸鹽含量的影響Fig.6 The effects of two factors on the nitrate content in pickled cabbage

2.4.3 驗證實驗 根據響應面實驗結果,通過Design Expert.V 8.0.6.1求解方程,得出最優條件:食用醋酸加入量11.37%,腌制溫度21.24 ℃,維生素C加入量0.23%,腌制25 d,考慮到實際運用和腌制條件的可操作性采用最優腌制條件：食用醋酸加入量11%，腌制溫度21 ℃,維生素C加入量0.2%，腌制時間21 d,平行三組實驗測得腌制大白菜中亞硝酸鹽含量平均值為16.47 mg/kg,顯著優于空白組17.9 mg/kg(p<0.05)與理論預測值(16.38 mg/kg)相差0.5%,表明采用響應面法優化腌制大白菜中亞硝酸鹽含量具有良好的真實可靠性。

3 結論

本文探究了大白菜腌制過程中的亞硝酸鹽含量變化,并得知腌制大白菜一定要保證腌制的天數足夠,才能避免因誤食腌制天數不足而造成的亞硝酸鹽中毒。腌制大白菜在20 d時,亞硝酸鹽的含量為19.8 mg/kg低于國標20 mg/kg,且之后也是逐漸降低,在25 d的時候降到17.9 mg/kg,并趨于相對穩定,食用相對安全。食用醋酸加入量、腌制溫度、維生素C對腌制大白菜中亞硝酸鹽產生量都有顯著影響,并且各影響因素對腌制菜中亞硝酸鹽含量的主次順序為:食用醋酸含量>溫度>維生素C含量。腌制25 d時,利用響應面優化法最終得到最佳腌制條件為:食用醋酸加入量11%,腌制溫度21 ℃,維生素C加入量0.2%,并檢測得到腌制大白菜中亞硝酸鹽含量16.47 mg/kg,顯著低于空白組17.9 mg/kg數值(p<0.05)。因此本文優化腌制條件對生產生活具有良好的指導意義,并為更深入探究其他腌制菜中的亞硝酸鹽含量提供依據。