響應面優化羅非魚下腳料發酵制備蛋白肽的工藝

劉喚明,洪鵬志,*,周春霞,楊 萍,陳康健,吳金紅

(1.廣東海洋大學食品科技學院,廣東省水產品加工與安全重點實驗室,廣東省現代農業科技創新中心,廣東湛江 524088;2.廣東省水產品深加工及副產物高值化利用工程技術研究中心,湛江恒興水產科技有限公司,廣東湛江 510300)

我國羅非魚養殖產量和加工產量居于世界首位。冷凍羅非魚片是羅非魚加工的主要產品,但在其加工過程中會產生40%～55% 的下腳料[1-2]。羅非魚下腳料有較高的蛋白質含量,且富含必需氨基酸[3],具有較高的利用價值。然而,目前國內絕大多數羅非魚下腳料被加工成低級魚粉出售,其價值并未得到充分利用,因此迫切需要尋找到羅非魚下腳料的高值化利用途徑。水產蛋白水解后可以產生具有抗氧化、抗菌、降血壓和免疫調節等多種生理功能的活性多肽[4],因而制備活性肽是水產蛋白高值化利用的研究熱點。目前,國內研究人員對羅非魚下腳料的酶解工藝進行了大量的研究[5-8]。

現在國內多采用酶解法來制備水產蛋白多肽,此方法有工藝程序相對簡單、易操作等,但其成本較高,且對水產蛋白固有的腥味沒有去除作用。發酵法不但可利用微生物發酵產生的蛋白酶來降低活性肽的生產成本,而且還可通過微生物復雜的生化過程可在一定程度上去除水產蛋白固有的腥味[9],因而,近年來有關發酵法制備水產蛋白肽的研究得到了研究人員的關注[10-14]。

枯草芽孢桿菌是一種傳統的發酵食品菌株,早在一千多年前日本利用枯草芽孢桿菌發酵生產他們的傳統食品——納豆。枯草芽孢桿菌具有豐富的產酶能力,其生產的蛋白酶、淀粉酶、糖化酶和脂肪酶等廣泛應用于食品工業。目前,研究人員已將枯草芽孢桿菌廣泛地應用于發酵法制備乳蛋白肽[15]、大豆肽[16-17]和膠原蛋白肽[12]等多種蛋白肽。本研究以枯草芽孢桿菌為出發菌株,利用響應面實驗對其發酵羅非魚下腳料制備蛋白肽的工藝進行優化,以期進一步提高羅非魚下腳料蛋白質的水解度,為羅非魚蛋白肽的發酵制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚下腳料 去除羅非魚下腳料中的內臟和魚皮,清洗下腳料中保留的魚頭、魚骨及其附著的魚肉,用絞肉機將清洗干凈的保留物絞碎,絞碎物置于-20 ℃冰箱中凍藏備用,湛江亞洲水產科技有限公司;枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)HL-1 廣東海洋大學食品科技學院海洋生物制品研究團隊;LB液體培養基(%):牛肉膏0.5，蛋白胨1，NaCl 0.5，pH7.2 實驗室自制;茚三酮 分析純,汕頭市西隴化工有限公司;甘氨酸 分析純,山東佰仟化工有限公司。

HZQ-F160型恒溫搖床 金壇市萬華實驗儀器廠;YXQ-SG46-280SA型滅菌鍋 上海博訊實業有限公司;CR22G II型高速冷凍離心機 日本日立公司;UV-210PC型分光光度計 上海森超貿易有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 羅非魚蛋白肽的制備方法 將Bacillus subtilis HL-1菌株接種于LB液體培養基中,并于37 ℃、150 r/min振蕩培養(15±0.5) h。培養結束后將培養液用無菌LB液體培養基調整混合液的OD630至1.01～1.05制備種子液備用。將絞碎后一定質量的羅非魚下腳料解凍后放入到250 mL三角瓶中,加入一定的蒸餾水和葡萄糖,并于121 ℃滅菌20 min。冷卻后接入Bacillus subtilis HL-1的種子液,然后將接入種子液的三角瓶置于恒溫振蕩搖床中,一定溫度下,150 r/min培養一定時間發酵結束后于8000 r/min離心10 min,收集上清液;最后將上清液置于95 ℃保溫5 min進行滅酶,得到羅非魚下腳料蛋白肽水溶液。

1.2.2 水解度測定方法 參考劉喚明等[12]的方法測定發酵后羅非魚下腳料蛋白的水解度。

1.2.3 爬坡實驗(Plackett-Burman,PB)設計 分別選取羅非魚下腳料添加量、培養基裝載量、葡萄糖添加量、發酵溫度、接種量、發酵時間和接種時間這7個因素的高、低2個水平,采用PB法設計7因素2水平的實驗,實驗因素及水平編碼如表1所示。以羅非魚下腳料蛋白的水解度為響應值,通過比較各因素的顯著性水平,篩選出對羅非魚下腳料蛋白的水解度的影響較為顯著的因素。

表1 Plackett-Burman設計的因素水平及編碼Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiment design

1.2.4 最陡爬坡實驗 以羅非魚下腳料蛋白的水解度變大的梯度方向為爬坡方向,在PB實驗及其分析結果的基礎上設計最陡爬坡實驗,選取對羅非魚下腳料蛋白的水解度的影響較為顯著的因素進行梯度設計,正效應的顯著因素其梯度為遞增,負效應的顯著因素其梯度為遞減,具體實驗安排見表5。

1.2.5 Box-Behnken實驗設計 以最陡爬坡實驗的極值點作為響應面設計的中心點,采用Box-Behnke實驗設計進行響應面實驗,因素和水平見表2。通過實驗數據擬合響應面模型,得到二次多項式,據此建立水解度與對其影響較為顯著的因素之間的經驗模型。

表2 響應面分析實驗因素及水平Table 2 Factors and their coded levels tested in response surface analysis

1.2.6 羅非魚蛋白肽分子量分布的測定 參照陳星等[18]的方法,采用高效體積排阻色譜法(High Performance Size Exclusion Chromatography,HPSEC)分析經響應面優化后制備的羅非魚蛋白肽的分子量分布情況。羅非魚蛋白肽水溶液測定前過0.22 μm微濾膜。使用色譜柱:TSKgel G2000 SWXL(300 mm×7.8 mm);柱溫:30 ℃,流動相:超純水∶乙腈∶三氟乙酸=55∶45∶0.1;流速:0.5 mL/min;測定紫外檢測波長:220 nm;進樣量:10 μL。分子量標準品為:細胞色素C(12500 u);抑肽酶(6500 u);桿菌酶(1450 u);乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(451 u);乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(189 u)。根據出峰時間和分子量大小的對數作分子量標準線性回歸方程為 Lg Mr=-0.231x+7.051(R2=0.995),樣品的分子量根據其洗脫時間和標準曲線求得。

1.3 數據處理

所有實驗做3個平行。用Minitab17.0軟件對PB實驗進行設計和數據分析,用Minitab17.0軟件對Box-Behnken實驗進行設計和數據分析

2 結果與分析

2.1 PB實驗設計及優化

PB實驗設計及結果見表3,其統計分析結果見表4。由表4結果可知:羅非魚下腳料添加量、葡萄糖添加量和發酵時間對水解度呈正效應,裝液量、發酵溫度、接種量和接種時間對水解度呈負效應;其中裝液量、發酵溫度和羅非魚下腳料添加量羅非魚下腳料添加量對水解度的影響均顯著(p<0.05)。因此選擇裝液量、發酵溫度和羅非魚下腳料添加量羅非魚下腳料添加量這3個因素作為主要影響因素進行最陡爬坡實驗和響應面實驗。

表3 Plackett-Burman實驗設計方案與結果Table 3 Plackett-Burman design and results

2.2 最陡爬坡實驗結果

由表4結果可知,羅非魚下腳料添加量是正效應,所以在最陡爬坡實驗中它的變化方向是遞增的;而裝液量和發酵溫度是負效應,因而在最陡爬坡實驗中它們的變化方向是遞減的。由表5結果可知,水解度在第3組達到最大值,因而以羅非魚下腳料添加量羅非魚下腳料添加量為12%、裝載量為40 mL/250 mL和發酵溫度為33 ℃作為響應面實驗的中心點。

表4 Plackett-Burman實驗結果對水解度影響的統計Table 4 Statistical analysis of the Plackett-Burman experiment results on degree of hydrolysis

表5 最陡爬坡實驗安排及結果Table 5 Experimental design and results of steepest ascent

2.3 響應面實驗優化發酵工藝

表6 Box-Behnke實驗設計及其結果Table 6 Experimental design and results of Box-Behnken experiment

表7 回歸方程的方差分析表Table 7 Variance analysis for regression equation

2.3.2 響應面分析和最佳發酵工藝確定 羅非魚下腳料添加量與裝載量、羅非魚下腳料添加量與發酵溫度、裝載量與發酵溫度之間的交互作用如圖1所示。從圖1可以看出響應面都為開口向下的凸形曲面,說明實驗存在水解度的最大值。裝載量與羅非魚下腳料添加量的響應面圖和發酵溫度與羅非魚下腳料添加量的響應面圖都比較陡峭,且它們的等高線呈橢圓,這說明它們的交互作用比較顯著,這與表7的回歸分析結果一致。運用Minitab17.0軟件對上面二次回歸方程中的響應值求最大值,得出極值點為X1=0.899、X2=0.859、X3=0.677,并由計算得出相應的羅非魚下腳料添加量為13.8%、裝載量為48.6 mL/250 mL、發酵溫度為34.4 ℃,預測的水解度最大值為33.26%。

圖1 兩因素間交互作用對水解度影響的響應面圖Fig.1 Response surface plots showing the interaction of parameters on the degree of hydrolysis

2.3.3 驗證實驗 為了驗證預測值的準確性,依照上面響應面分析得到的最佳發酵工藝,并結合實際實驗操作的可行性,選取羅非魚下腳料添加量為13.8%、裝載量為48.6 mL/250 mL、發酵溫度為34 ℃。并在上述工藝下做了3次重復實驗,測定水解度的結果分別為33.15%、33.02%和33.20%,平均值為33.12%,與預測值(33.26%)基本一致,說明該模型可較好地預測實際發酵情況。

2.4 羅非魚蛋白肽的分子量分布情況

經響應面優化后制備的羅非魚蛋白肽的分子量分布情況用高效體積排阻色譜法分析測定。由圖2結果可知,羅非魚蛋白肽的出峰時間集中在15～25 min之間。由表8結果可知,羅非魚蛋白肽的分子量都在5000 u以下,且分子量在231～637 u蛋白肽所占的比例為74.058%。根據海洋魚低聚肽粉的國家標準[19],分子量在1000 u以下的為低聚肽。因而本研究制備的羅非魚蛋白肽中低聚肽含量達74.058%。

圖2 羅非魚蛋白肽的HPSEC圖譜Fig.2 HPSEC chromatogram of peptide from tilapia scraps

表8 羅非魚蛋白肽的分子量分布Table 8 Molecular weight distribution of the peptide from tilapia scraps

3 結論

本研究以實驗室保藏的枯草芽孢桿菌HL-1為發酵菌株,采用響應面實驗對其發酵羅非魚下腳料制備蛋白肽的工藝進行了優化。首先通過Plackett-Burman實驗篩選出影響水解度的顯著因素:羅非魚下腳料添加量、裝液量和發酵溫度。接著通過最陡爬坡實驗逼近最大水解度區域。最后利用Box-Behnken實驗進行響應面分析,確定最佳發酵工藝為:羅非魚下腳料13.8%、發酵溫度為34 ℃、裝載量為48.6 mL/250 mL。優化后羅非魚下腳料中蛋白質的水解度高達33.12%,制備的羅非魚蛋白肽中低聚肽含量高達74.058%。