黃酒發酵過程中微生物篩選及菌株產香分析

張 超,劉雙平,,鄒慧君,周志磊,3,韓 笑,3,4,姬中偉,3,王宗敏,3,毛 健,3,4,*

(1.江南大學,糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室,江蘇無錫 214122;2.浙江古越龍山紹興酒股份有限公司,浙江紹興 312000;3.國家黃酒工程技術研究中心,浙江紹興 312000;4. 江蘇省產業技術研究院食品生物技術研究所，如皋江大食品生物技術研究所有限公司,江蘇南通 226500)

黃酒作為中國古老的、特有的酒種,其起始可以追溯到五千年以前[1]。因為黃酒“低度、營養、保健”,因而被廣大消費者贊譽為“液體蛋糕”,在中國的江浙滬區域黃酒在酒類消費當中始終排名前列[2]。黃酒由于其特殊的開放式以及濃醪發酵形式,使得參與發酵的微生物菌群具有多樣性的特點,酵母、霉菌和細菌等均參與其中[3-4]。目前對于機械黃酒發酵過程中的菌株分離主要集中在細菌類,尤其是乳酸菌,而對于真菌的分離報道較少[5-7]。

黃酒中的揮發性風味物質是酒體評價的重要標志之一。眾所周知,隨著黃酒酒齡的增長,揮發性風味物質的變化而使得黃酒的風味變得愈加醇厚[8-9]。目前認為黃酒中的揮發性風味物質的主要來源是原料帶入和微生物發酵產生。在黃酒發酵過程中,微生物代謝將發酵醪液中的糖、有機酸、氨基酸、風味前體物質轉化為醇類、酸類、酯類、醛酮類、雜環類等揮發性風味物質,在發酵過程中產生的風味物質多種多樣,對于黃酒的整體風味極具影響,因此微生物的發酵作用是造成黃酒風味成分復雜的重要原因之一[10-12]。

本研究取古越龍山的機械黃酒發酵第1、2、3、4、5、7、10、15、22 d醪液,利用傳統微生物分離培養方法,分析黃酒發酵過程中細菌及真菌的組成;并分析菌株在黃酒模擬液中生長情況,研究其在黃酒模擬液中產揮發性風味物質的特性。從而全面的了解在發酵過程中微生物的組成,并更加實際的探討了微生物在黃酒發酵過程中利用黃酒生產所用原料所產生的揮發性風味物質,為科學管理生產、提高黃酒風味品質奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

發酵醪液 紹興古越龍山黃酒廠,發酵第1、2、3、4、5、7、10、15、22 d,取樣后于4 ℃冰箱暫存;麥曲、糯米、糖化酶、液化酶等 紹興古越龍山酒廠;標準品:乙醛、異丁醛、乙酸乙酯、3-甲基丁醛、異丙醇、丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、異丁醇、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、正丁醇、異戊醇、己酸、己酸乙酯、乳酸乙酯、正己醇、辛酸乙酯、正庚醇、糠醛、苯甲醛、2,4-二甲基苯甲醛、1-辛醇、γ-丁內酯、癸酸乙酯、苯甲酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、月桂酸乙酯、正己酸、β-苯乙醇、庚酸、苯酚、乙偶姻、γ-壬內酯、4-乙基愈創木酚、正辛酸、肉桂酸乙酯、γ-癸內酯、十五酸乙酯、丁香酚、壬酸、4-乙烯基愈創木酚、棕櫚酸乙酯、癸酸、2,4-二叔丁基苯酚 純度>99%，上海安普科學儀器有限公司。

Thermo Micro CL17型高速離心機 美國賽默飛世爾科技公司;紫外可見分光光度計 優尼柯(上海)儀器有限公司;CX31RTSF型顯微鏡 日本OLYMPUS公司;立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;恒溫培養箱 上海森信實驗儀器有限公司;恒溫搖床 上海合恒儀器設備有限公司;低速大容量多管離心機 無錫瑞江分析儀器有限公司;Thermo Fisher Trace GC-MS 賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 微生物的分離與純化 霉菌分離培養基:PDA 固體培養基。酵母分離培養基:YAP固體培養基:葡萄糖1%,蛋白胨1%,酵母膏1%,氨芐青霉素,1%丙酸鈉,瓊脂2%(注:氨芐青霉素鈉為細菌抑制劑,用量為100 μg/mL不可高溫加熱)。細菌分離培養基:LB固體培養基:牛肉膏3‰,蛋白胨1%,氯化鈉5‰,瓊脂2%。MRS固體培養基:牛肉膏1%,蛋白胨1%,酵母膏5‰,葡萄糖2%,吐溫80 0.1‰,醋酸鈉 5‰,磷酸氫二鉀2‰,檸檬酸二銨2‰,硫酸鎂0.58‰,硫酸錳0.28‰,瓊脂2%[13-14]。

以上培養基均自然pH,121 ℃滅菌20 min。黃酒發酵醪液樣品稀釋到合適的梯度,每梯度3個重復,涂布上述5種培養基平板,分別進行好氧培養與厭氧培養。每天觀察菌落形態并挑選出形態不同的微生物進行劃線純化培養,最后經3次劃線純化得到純培養物。比較各純培養物形態,剔除形態一致的純培養物。

1.2.2 分離微生物菌株鑒定

1.2.2.1 利用CTAB法提取菌株DNA 菌株培養液,每1 mL分裝于2 mL EP管中,加入10 μL溶菌酶(50 mg/mL),37 ℃條件放置30 min;加入125 μL 10%的SDS溶液,立即加入5 μL蛋白酶K(20 mg/mL),混均后 65 ℃水浴2 h(每隔10 min上下顛倒混均樣品);6000×g離心10 min,取上清液。之后加入700 μL CTAB提取緩沖液(2% CTAB,1.4 mol/L NaCl,1 mol/L Tris-HCl,0.5 mol/L EDTA),混均后65 ℃水浴1 h,每隔10 min上下顛倒混均樣品[15]。300×g低速離心5 min,取清液而舍棄上面泡沫層及下面的雜質。300×g低速離心5 min,取清液而舍棄上面泡沫層及下面的雜質。之后用等體積的氯仿-異戊醇(體積比24∶1)混均后于4 ℃條件下,12000×g離心10 min,重復操作2～3 次,至基本無中間雜質層;用0.6倍體積的異丙醇沉淀DNA,輕輕混勻后于-20 ℃沉淀1 h后于冷凍離心機12000×g下4 ℃離心10 min,收集核酸沉淀;加入1 mL 70%的乙醇,于4 ℃條件下,12000×g離心10 min,洗滌沉淀2～3 次,倒扣，去除過量水分,于37 ℃干燥DNA。加50 μL dd水溶解沉淀,得到的DNA樣品置于-20 ℃冰箱保存備用。

1.2.2.2 進行PCR擴增 細菌:通用引物,上游引物序列為27f:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAC-3′,下游引物序列為1492r:5′-TACGGCTACCTTGTT ACGACTT-3′,擴增片段大小為1500 bp左右。細菌PCR反應體系參照文獻[16]。

真菌:通用引物,上游引物序列為NS1:5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′,下游引物序列為NS8:5′-TCCGCAGGTTCACCTACGCGA-3′,擴增片段大小為1700 bp左右;真菌PCR反應體系參照文獻[17]。

1.2.2.3 序列分析及系統發育樹構建 PCR產物送至南京金斯瑞生物技術有限公司進行測序對微生物進行生物性鑒定。測序所得到序列在NCBI中GeneBank上進行BLAST比對,確定與已知序列的同源關系。采用MEGA6.1系統發育與進化分析。

1.2.3 黃酒模擬液及菌株發酵液制備 實驗采用黃酒原料制作黃酒模擬液。取0.100 kg米粉,加入0.86 g麥曲及2 L清水,添加2 mL液化酶,90 ℃液化2 h;用乳酸調節pH至4.0,加入2 mL糖化酶,60 ℃糖化2 h作為黃酒模擬液。

1.2.3.1 酵母及細菌種子液及發酵液制備 一級種子液制備:從甘油保藏管中挑取一環于50 mL液體培養基上,酵母接種至液體YPD,30 ℃培養,好氧細菌接種至液體LB,37 ℃培養;厭氧細菌接種至液體MRS,37 ℃厭氧培養;菌株均培養24 h。上述培養菌株,再按照接種量5%轉接一次,作為一級種子液。

二級種子制備:取一級種子液5 mL接種至50 mL黃酒模擬液中,30 ℃靜置培養,分別在2、5、8、12、20、30、40、48、60 h搖勻取樣,測定OD600值。繪制各菌在黃酒模擬液中的生長曲線,以各菌的生長穩定期初始時刻時菌液作為二級種子液。

發酵液制備:吸取培養各菌二級種子液5 mL接種至裝有50 mL黃酒模擬液100 mL離心管中,30 ℃靜置培養120 h。

1.2.3.2 霉菌發酵液制備 從甘油保藏管中挑取一環菌株劃線于PDA標準固體培養平板上,30 ℃培養,待長出菌苔后劃線至茄形瓶PDA標準固體培養基內,30 ℃培養48 h,用無菌水洗出孢子,得到孢子懸浮液,振蕩混勻后于顯微鏡下進行血球板計數,調整孢子濃度為107個/mL,吸取10 mL孢子懸浮液接種至裝有200 mL黃酒模擬液錐形瓶當中,同時錐形瓶當中加入10顆玻璃珠,30 ℃ 200 r/min搖床培養120 h,不定期用力振蕩搖勻培養基以防霉菌結成球狀。每隔12 h取5 mL發酵液,4 ℃,10000 r/min離心10 min,洗滌沉淀,相同條件下離心,沉淀部分105 ℃烘干至恒重,測菌絲重量。以培養時間為橫坐標,菌絲干重為縱坐標,繪制菌株的生長曲線。同樣方法得到霉菌孢子濃度為107個/mL,吸取5 mL孢子懸浮液接種至裝有50 mL黃酒模擬液100 mL離心管中,30 ℃靜置培養120 h。

1.2.4 揮發性風味物質測定 本次研究采用頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜聯用技術(HS-SPME/GC-MS)測定揮發性風味物質,具體操作參照相關文獻并稍有改動[18]。

1.2.4.1 前處理 取發酵液6 mL于20 mL頂空瓶中,加入2.5 g氯化鈉及20 μL內標溶液(2-辛醇,濃度為22 mg/L),插入三相萃取頭,于50 ℃條件下吸附45 min,250 ℃解吸附7 min,用于GC-MS測定。

1.2.4.2 GC-MS條件 GC色譜柱,TG-WAXMS(30 m×0.25 μm×0.25 mm)。GC進樣口溫度,250 ℃。GC程序升溫,40 ℃保持3 min;6 ℃/min升溫至10 ℃。10 ℃/min升溫至230 ℃,保持7 min。GC載氣,高純氦氣(>99.999%),不分流,流速為1.0 mL/min。MS離子化方式,EI。MS發射電流,50 μA。MS電子能量,70 eV。MS離子源溫度,230 ℃。MS傳輸線溫度,250 ℃。MS掃描范圍,33～400 amu。

1.2.4.3 定性及定量分析方法 定性:通過與NIST 2.0(Agilent Technologies Inc.)數據庫比對,對物質定性。

定量:將各種風味物質標品混合并稀釋,配成不同濃度的混合標準溶液,具體標品濃度范圍配制參見文獻[19],濃度均大于1 μg/L。相同條件下進樣,繪制濃度-峰面積標準曲線,通過測定樣品中揮發性風味物質峰面積與標樣得到的標準曲線峰面積對樣品中揮發性風味物質進行定量。對于風味物質含量未能在標曲范圍內,以及其他未能購買標準品揮發性風味物質采用2-辛醇作為內標進行半定量計算。

其中:C為樣品中被檢測到的揮發性風味物質含量;Cis為內標物的含量;A1為樣品中被檢測到的揮發性風味物質的峰面積;A2為內標物的峰面積。

2 結果與分析

2.1 微生物的分離及生物鑒定結果

2.1.1 細菌分離結果 實驗從黃酒發酵醪液中共分離出33株細菌,其中有5株最后鑒定為乳酸菌。由表1可知,發酵醪液中的細菌主要有芽孢桿菌屬(Bacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸桿菌屬(Enterobacter)、泛菌屬(Pantoea)、魏斯菌屬(Weissbacteria)、梭菌屬(Clostridium)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)等。張鳳杰等[6]利用傳統培養方法對麥曲、浸米水和黃酒發酵醪中的細菌進行分離和鑒定,共分離出41株細菌,主要為乳桿菌屬、片球菌屬、醋酸桿菌屬和芽孢桿菌屬等4個屬,在發酵醪液中主要為芽孢桿菌屬。胡志明等[7]在黃酒發酵醪液中篩出13種細菌,其中12株是芽孢桿菌屬(Bacillus),1株是乳酸菌屬(Lactobacillus);馮浩等[20]從黃酒發酵醪液中分離出3株乳酸菌,分別為1株植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和2株希氏乳桿菌(Lactobacillusjohnsonii);吳春[21]在黃酒醪液中分離出13中原核微生物,均為芽孢桿菌屬(Bacillus)。此次研究共從黃酒發酵醪液中篩選分離出17株芽孢桿菌屬和5株乳酸菌屬細菌,由此可以看出,黃酒發酵醪液中主要為芽孢桿菌屬和乳酸菌屬。此外,本次研究還篩選分離出腸桿菌屬(Enterobacter)等其他菌屬,這可能是由于麥曲等原料的制作方式和環境的不同,導致黃酒發酵醪液篩選分離結果的稍有不同。

此外,由表1可知,菌株L12和L26均為Bacillusaerius,L61和L291是同一種菌(Aeribacilluspallidus),L36、L52、L171及L172均鑒定為Bacillusaryabhattai,乳酸菌M9和M34均鑒定為Lactobacillusfermentum。剔除鑒定相似菌株,采用MEGA6.1對發酵醪液中分離培養的細菌測序結果構建系統進化樹如圖1所示。

圖1 細菌系統發育樹Fig.1 Phylogenetic relationships of 16S rDNA sequences of bacteria

圖2 真菌系統發育樹Fig.2 Phylogenetic relationships of 18S rDNA sequences of fungi

表1 細菌生物鑒定比對表Table 1 Sequencing results of the isolated bacterial strains

續表

2.1.2 真菌分離結果 由表2可得，實驗從發酵醪液中分離出16株霉菌以及4株酵母,包括傘狀毛霉菌,傘枝犁頭霉,擴展青霉,婁地青霉,釀酒酵母等。發酵醪液中的霉菌主要是來自于麥曲中[4],目前對于從發酵醪液中分離真菌較為少見,常見是從麥曲中篩選分離出真菌,毛青鐘[4]從傳統發酵方式的發酵醪液中分離出55株酵母,而本次研究從醪液中篩選分離出4株酵母,由此可以看出傳統發酵方式相對機械黃酒發酵方式的更復雜性;陳建堯等[22]從機械麥曲中分離出13個霉菌屬,主要為犁頭霉屬(Absidiacorymbifera)、曲霉屬(Aspergillusoryzae)、毛霉屬(RhizomucorPusillus)、青霉屬(Penicilliumaurantiogriseum)、畢赤酵母屬(Pichiaburtonii)等。方華[23]采用傳統的微生物分離方法對黃酒麥曲中的真菌進行了分離培養和鑒定,共分離出16株霉菌,其主要霉菌分別是傘枝犁頭霉、米曲霉、微小毛霉、米根霉和煙曲霉。而本次研究從發酵醪液中同樣篩選分離出犁頭霉屬(Absidiacorymbifera)毛霉屬(RhizomucorPusillus)、青霉屬(Penicilliumaurantiogriseum),由此可以推測,發酵醪液中霉菌的主要來源是原料中麥曲。采用MEGA6.1對發酵醪液中分離培養的真菌測序結果構建系統進化樹如圖1所示所示。

表2 真菌生物鑒定比對表Table 2 Sequencing results of the isolated fungal strains

2.2 黃酒模擬液中微生物的生長特性

2.2.1 黃酒模擬液理化指標 實驗測黃酒模擬液基本理化指標如下表3,由表可知,除酒精度外,黃酒模擬液的基本理化指標與黃酒發酵第1 d類似[4]。由于微生物對酒精度的耐受性不同,故而本次實驗均控制酒精度為0 °。

表3 黃酒模擬液基本理化指標表Table 3 Basic physical and chemical indexes of the special culture medium

2.2.2 菌株生長曲線 細菌、酵母菌株在黃酒模擬液下的生長曲線如圖3～圖4,霉菌生長曲線如圖5所示。通過對分離微生物在黃酒模擬液中的生長情況監測,發現除乳酸菌外的細菌在24 h內生長均是處于延滯期,在此之后,菌株L211、L311、L31、L18在48 h時達到穩定期;在60 h時,菌株L12、L171、L272、L172、L172、L5、L1、L291、L14、L22、L61達到生長穩定期;72 h時,菌株L36、L341、L101、L72、L2、L35、L201、L3、L71、L26、L15、L212、L8、L14達到生長穩定期。乳酸菌在黃酒模擬液中生長適應較快,均在48 h時到達穩定期。分離純化酵母菌在19 h均達到生長穩定期,霉菌除去菌株CO1和MY4在48 h達到穩定期,其余霉菌菌株在72 h達到穩定期;此外,除菌株CO1和MY4外,霉菌利用黃酒模擬液生長趨勢很一致。

圖3 細菌生長曲線圖Fig.3 Growth curves of bacteria

圖4 酵母菌生長曲線圖Fig.4 The growth curves of yeast

圖5 霉菌生長曲線圖Fig.5 Growth curves of yeast mould

2.2.3 產揮發性風味物質分析 本研究利用頂空固相微萃取(HS-SPME)結合氣質聯用(GC-MS)菌株產揮發性風味情況,通過與NIST 2.0(Agilent Technologies Inc.)數據庫比對,對物質定性,共檢測出142種風味物質,通過外標定量和內標法結合分析,對物質進行定量分析。如圖6所示,是篩選菌株產總揮發性風味物質含量圖;測定未添加菌株的黃酒模擬液的風味,以排除在制作黃酒模擬液中由原料和麥曲帶入的風味物質;由圖6可知細菌中菌株L311產揮發性風味物質總含量最高,其次是菌株L15;真菌中,霉菌中菌株C01產揮發性風味物質最為突出。此外,比較黃酒模擬液中的風味物質總含量,細菌中菌株L52、L341以及霉菌中菌株C112、C121、C22、C14、C141、P181等未有增長,表明這些菌株產揮發性風味物質能力較弱。分離培養酵母中,Y7菌株產揮發性風味物質最高,達3456.57 μg/L,其他酵母Y3、Y4、Y9產揮發性風味物質總量分別為2985.93、3014.08、3003.18 μg/L。

圖6 菌株產揮發性化合物總量Fig.6 Total volatile compounds produced by strains注:CK表示黃酒模擬液,未添任何菌株發酵培養;圖中編號以L、M、X起始為細菌,C、MY、P為霉菌;以Y起始為酵母菌。

如表4所示,為菌株所產總揮發性風味物質含量大于480 μg/L的10株菌株,以及酵母菌株Y7。由結果可知,除酵母外,醇類物質中,菌株C01產出最高,總醇類物質含量達275.83 μg/L,而在菌株C01所產醇類物質中,產2,3-丁二醇最為突出,為231.23 μg/L。揮發性酸類物質中,菌株L311產揮發性酸類物質最多,達261.66 μg/L,己酸為菌株L311產出最高,為160.58 μg/L。除此之外,菌株L311在總脂類和總酮醛類化合物產出也最高,分別為28.05和610.92 μg/L。酮醛類物質當中,菌株產乙偶姻明顯要高于其他風味物質。總芳香族類化合物含量中,菌株C122產出最高,達到33.96 μg/L。酵母菌株在產醇類物質尤為突出,產總醇類物質達1519.0 μg/L;此外,由于未對乙醇進行研究,所以未列出酵母產乙醇能力。

表4 10種菌株產風味表(μg/L)Table 4 Table of 10 strains producing flavor(μg/L)

3 結論與討論

通過傳統的分離培養,從發酵醪液中共篩選出53株菌株,其中有33株細菌、16株霉菌以及4株酵母,傳統分離培養的方法可以從個體上探討微生物菌株的生長特性,從而初步推斷菌株在發酵體系當中所作出的貢獻,能有效的對現在流行的測序手段進行補充。本次篩選分離出的細菌當中,分別有17株和5株隸屬于芽孢桿菌屬和乳酸菌屬,由此可知,黃酒發酵醪液中可分離培養分離的細菌主要是芽孢桿菌屬和乳酸菌屬;霉菌中篩選分離出犁頭霉屬(Absidiacorymbifera)毛霉屬(RhizomucorPusillus)、青霉屬(Penicilliumaurantiogriseum)等,結合前人研究,可以推斷發酵醪液中霉菌主要的來源是原料中的麥曲。本次研究發現,菌株L311(Clostridiumtyrobutyricum)在產風味物質的總含量要明顯高于其他細菌,霉菌中菌株C01(Penicilliumexpansum)產揮發性香氣物質要高于其他霉菌,而在黃酒模擬中,菌株L311和C01分別在48 h和60 h達到穩定期;酵母菌在利用黃酒模擬液產香氣物質明顯要高于其他菌株,這與其他研究及其類似[23-24]。

紹興古越龍山機械化黃酒采用大罐發酵的形式,但是由于發酵罐中的微生物的生長情況多變且復雜,并且由于微生物之間的相互關系的影響以及微生物自身不可培養的特性,醪液當中的微生物不能夠完全利用傳統的分離培養方法分離得到。因此,對于發酵過程中的微生物的組成情況還不能僅僅依靠傳統的分離培養方法,對于不能分離的微生物還需借助現今分子測序手段進行分析。分離培養的微生物菌株利用黃酒模擬液產香氣物質可初步分析出微生物的產香氣物質的能力和種類,但是對于菌株在真正的發酵體系當中,篩選菌株所能提供的香氣成分有待進一步展開分析探討。