響應面優化堿醇預處理麥草酶解效率及木質素組分分離

周 靜,沈葵忠,*,房桂干,2,鄧擁軍

(1.中國林業科學研究院林產化學工業研究所,國家林業局林產化學工程重點開放性實驗室,生物質化學利用國家工程實驗室,江蘇南京 210042;2.南京林業大學林業資源高效加工利用協同創新中心,江蘇南京 210037)

木質纖維生物質是重要的可再生資源[1]。我國作為農業大國,每年會產生大量的稻草、麥草等農業秸稈生物質,利用農業秸稈等生物質為原料制備可發酵性糖類,進而制備燃料乙醇及其他化學品,提高其附加值,對緩解能源危機和保護環境具有重要意義[2-3]。麥草等農業秸稈主要由纖維素、半纖維素和木質素三大組分構成,三者之間存在復雜的化學鍵連接,形成的天然復雜高分子結構,對生物酶具有很強的抵抗能力,使得直接對其酶解糖化效率極低。需要經過一定的預處理操作打破其致密結構,增加生物酶對底物的可及性,從而提高酶解效率[4]。木質素屬于芳香族化合物,廣泛存在于植物界中且含量豐富,有巨大潛在應用價值[5]。但由于其結構缺少重復單元之間的有序性和規律性,結構復雜,造成木質素開發利用的困難,至今沒有得到很好的利用。

目前常用的預處理方法主要有酸法預處理[6]、蒸汽爆破預處理[7]、高溫熱水預處理[8-9]、有機溶劑預處理等[10]。其中,有機溶劑預處理與其他預處理相比,具有選擇性,受到研究人員的關注。乙醇是一種常用的有機溶劑,且可通過蒸發能回收循環使用。但不使用催化劑的乙醇預處理溫度較高,常控制在200 ℃左右,并在后續洗滌步驟中,因體系溫度降低溶出的木質素會吸附在物料表面導致較難洗凈等缺點[11]。堿性乙醇預處理麥草秸稈,堿溶液中OH-可斷裂木質纖維原料中酯鍵、醚鍵等化學鍵,使木質素大分子降解溶出[12]。可在較溫和的條件下將木質素從物料中分離并顯著提高物料的酶解糖化效率,并對預處理液中的木質素進行回收,以期實現秸稈類原料的全組分高值化利用。

本文使用氫氧化鈉為催化劑的堿性乙醇溶液為預處理藥劑,以預處理后物料的酶解總糖轉化率為響應值,采用響應面法對實驗條件進行了優化,建立了預處理工藝數學模型,確定了最佳預處理工藝條件。并通過對物料化學組分及結構形貌的分析,解釋了預處理使物料酶解率提高的原因。通過對降解溶出的木質素進行了回收提純和結構表征,為堿醇木質素的開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

麥草 取自山東棗莊農村,水洗除塵后風干,植物粉碎機粉碎,篩選0.180～0.425 mm的顆粒;纖維素酶(Celluclast 1.5 L,酶活127 FPU/mL)、β-葡萄糖苷酶(Novozyme 188,酶活350 IU/mL) Novozymes公司,酶活按文獻[13]提供的方法測定;氫氧化鈉、乙醇等 均為分析純,購買于國藥集團化學試劑有限公司;葡萄糖、木糖標準品 均為色譜純,購買于國藥集團化學試劑有限公司。

反應釜 采用型號為316 L的優質不銹鋼加工而成,內套為對位聚苯材料,購自鞏義市孝義合眾儀器有限公司;T6新世紀紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;傅里葉紅外光譜(FT-IR)儀 THERMO SCIENTIFIC;Agilent 1100色譜儀 美國安捷倫公司;Aminex HPX-87H色譜柱 美國伯樂公司;S-3400型掃描電鏡 日本東芝公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 堿醇預處理及木質素的組分分離 將6 g麥草加入反應釜,稱取一定量氫氧化鈉溶于體積分數為50%的乙醇溶液,保持固液比為1∶10 (g∶mL)。在設定的溫度反應一定時間,將反應釜取出放入冷水中冷卻至室溫。真空抽濾使固液分離,收集濾液,固體物料用蒸餾水洗滌至中性,室溫風干儲存于聚四氟乙烯塑料袋中用于化學成分分析和酶解使用。濾液用6 mol/L的HCl調節至pH2,有固體析出,在6000 r/min轉速下離心沉降回收得粗木素,按照Bjorkman方法提純[14],得堿醇木質素。為比較木素結構的變化,提取麥草原料中的磨木木素(MWL)作為參照。

1.2.2 酶解 稱取絕干質量0.3000 g堿醇木質素置于50 mL錐形瓶中,根據前期的初步實驗研究,加入20 FPU/g纖維素酶和20 IU/gβ-葡萄糖苷酶,加入12 mL pH為4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液,使固液比為1∶40,并加入一滴丙酮以防止水解過程中雜菌和微生物產生。將上述樣品置于50 ℃、150 r/min恒溫培養振蕩器中酶解48 h。反應結束后,將錐形瓶置于沸水浴中煮沸10 min,對其中殘存的纖維素酶滅活,采用HPLC測試酶解液中的糖含量。酶解總糖轉化率計算見公式(1)。

總糖轉化率(%)=(酶解得到的葡萄糖(g)×0.9+酶解得到的木糖(g)×0.88)/(底物中葡聚糖(g)+底物中木聚糖(g))×100

式(1)

式中:0.9和0.88分別是葡萄糖轉化為葡聚糖和木糖轉化為木聚糖時的轉化系數。實驗中以葡萄糖和木糖表示總糖含量。因麥草中阿拉伯糖、半乳糖等含量很少,可忽略不計。

1.2.3 響應面實驗設計 根據前期的初步實驗研究,確定了預處理溫度、堿用量和預處理時間作為影響麥草秸稈堿醇預處理的主要因素,以預處理溫度、堿用量(以預處理藥液中NaOH的質量分數表示)和預處理時間為自變量,每個因素取3個水平,以(-1,0,1)編碼根據Box-Behnken設計原理[15],采用3因素3水平的響應面分析方法,實驗因素水平見表1。

表1 響應面實驗因素及編碼水平設計Table 1 Factors and levels of the RSM experimental design

1.2.4 分析測試 糖含量的測定：原料的各化學組分含量按照美國可再生能源實驗室(NREL)所推薦的方法測定[16]。其中糖含量分析采用高效液相色譜(HPLC)測量,葡萄糖和木糖標準糖樣品經80 ℃恒重后溶于去離子水中配制系列梯度濃度,于HPLC中進樣,繪制標準曲線。以糖濃度為橫坐標x(mg/mL),峰面積為縱坐標 y,得到葡萄糖標準曲線:y=3.99794×10-6x+0.01456,R2=0.99992;木糖標準曲線:y=4.21963×10-6x+0.01473,R2=0.99998;檢測條件為:使用Aminex HPX-87H色譜柱,柱溫65 ℃,流速為0.6 mL/min,進樣量20 μL,0.005 mol/L H2SO4為流動相,示差折光檢測器(RI)進行檢測，外標法定量。

紅外光譜測定：采用溴化鉀壓片法。待測樣干燥后與KBr混合均勻,用瑪瑙研缽進行研磨,均勻后壓制成片,測定其紅外吸收光譜。

掃描電鏡分析:物料采用乙醇梯度逐級脫水,乙醇體積分數分別為30%、50%、70%、80%和90%,每級脫水時間15 min,再用100%的乙醇脫水兩次,每次15 min,低溫真空干燥后,在掃描電鏡上觀察表面形貌并照相、加速電壓15.2 kV。

1.3 數據處理

本文應用Origin 8.0軟件進行分析作圖,各組實驗重復三次,以平均值來表示;響應面設計與分析采用Design Expert 8.06軟件。

2 結果與分析

2.1 回歸模型的建立及顯著性檢驗

根據Box-Behnken 實驗設計原理。共設計了15個實驗點的響應面分析實驗,其中12個為分析點,零點實驗重復3次以估計實驗誤差。響應面實驗設計結果如表2所示。應用Design Expert 8.06軟件對表2數據進行多元回歸擬合,獲得總糖轉化率(Y)對預處理溫度(X1),堿用量(X2),預處理時間(X3)3個自變量的二次多項式回歸模型為:

表2 堿醇預處理的響應面優化分析結果Table 2 Result of the RSM optimization about the AEP

式(2)

表3 響應面回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of the response surface quadratic model

2.2 模型交互項的解析

為進一步研究各因素之間的交互作用對酶解的影響程度,對二次回歸模型進行響應面曲線圖及等高線圖分析。結果如圖1～圖3所示。

由圖1可知,保持預處理時間為3 h,溫度一定且處于較低水平時,酶解總糖轉化率隨堿用量的增加而增加的較快。當預處理溫度達到一定值時,在較低堿用量情況下即可達到較高的總糖轉化率,總糖轉化率隨堿質量分數的增加增長緩慢;當堿用量繼續增加,總糖轉化率略有降低。當堿用量一定,隨著預處理溫度的提高,總糖轉化率增加顯著,當溫度繼續增加,酶解總糖轉化率反而會有所下降。分析圖1可以發現,當溫度在130～140 ℃范圍內,堿用量在1.0%～1.4%范圍內,酶解總糖轉化率逐漸增加并達到極大值。

圖1 預處理時間為3 h條件下預處理溫度和堿用量對酶解總糖轉化率的影響Fig.1 Effect of temperature and alkaline charges on total sugar conversion when time was 3 h

從圖2可以看出,在堿用量固定為1%條件下,隨著溫度升高和時間的延長,酶解總糖轉化率呈現遞增的趨勢。當預處理溫度在130～140 ℃范圍內,時間在2～3 h范圍內,酶解總糖轉化率達到區間最大值。由圖3可知,當預處理溫度固定為130 ℃時,堿用量對酶解總糖轉化率的影響較時間顯著。時間一定時,酶解總糖轉化率隨堿用量的增加明顯增大。

圖2 堿用量為1%條件下預處理溫度和時間對酶解總糖轉化率的影響Fig.2 Effect of temperature and time on total sugar conversion when alkaline charges was 1%

圖3 溫度為130 ℃條件下堿用量和預處理時間對酶解總糖轉化率的影響Fig.3 Effect of Alkaline charges and time on total sugar conversion when temperature was 130 ℃

綜上所述,響應面曲線圖及等高線圖直觀地反映了各因素的交互作用對酶解總糖轉化率的影響。其中預處理溫度與堿用量的交互作用(X1X2)對酶解總糖轉化率的影響最為顯著,表現為曲面較陡;其他交互作用對酶解總糖轉化率的影響不顯著,表現為曲面較為平滑。這與方差分析的結果一致。

2.3 擬合優化條件的驗證

由Design-Expert 8.0.6軟件系統中的Box-Behnken Design設計模塊中的優化功能,可得最佳預處理條件為:預處理溫度139.73 ℃,堿用量1.19%,預處理時間2.37 h。此條件下的最高響應值為96.47%。為驗證響應面分析法的可靠性,采用實際條件預處理溫度140 ℃,堿用量1.19%,預處理時間2.37 h設置3組平行實驗進行驗證,酶解后總糖轉化率分別為96.45%、97.23%和96.66%,均值為96.78%。在誤差允許的范圍內,實驗值與模型優化模擬值基本一致,表明優化模型有較好可靠性。

2.4 化學組分與結構分析

2.4.1 化學成分分析 以響應面分析得出的最優條件處理麥草,得到預處理物料(PM)。對麥草原料(RM)和PM進行化學成分分析,結果如圖4。以麥草原料為基準,PM中木質素去除率達84.62%,PM中木質素的比例由原料的19%減小至4.59%。Marton R等[17]研究表明,堿醇溶液高效去木質素效果有兩方面原因:一方面溶劑中OH-可有效斷裂物料中酯鍵、醚鍵等化學鍵,使木質素降解;另一方面,乙醇對木質素有較好的溶解能力,降解的木質素可快速溶于乙醇,防止木質素在原料表面的累積。從而實現較溫和條件下木質素的有效分離[18]。纖維素和半纖維素在堿性溶液中,具有還原性末端基的葡萄糖基會被氧化而脫落,發生剝皮反應[19],從而也發生一定程度的降解。但由于乙醇是碳水化合物的貧溶劑,同時它還能使碳水化合物的還原性末端基異構化速度變緩,因而采用堿性乙醇為預處理試劑能抑制碳水化合物的剝皮反應,降低其在預處理過程中的無效降解,提高原料利用率[20]。由于木質素的大量去除,PM中纖維素和半纖維素比例增加,分別由原料的36.16%和22.70%提高至50.17%和28.25%。纖維素和半纖維素更多的暴露出來,增加了酶對底物的可及性,從而可提高酶水解效率。

圖4 RM和PM的化學組分分析Fig.4 Chemical composition analysis for RM and PM

2.4.2 木質素的結構分析 在最優預處理條件下,收集預處理濾液,回收并提純濾液中的木質素,得到堿醇木質素(AEL)。磨木木素(MWL)由于結構變化小,提取麥草原料的MWL作為表征時的參照。AEL和MWL的紅外光譜譜圖如圖5所示。

圖5 木質素樣品(RL和MWL)的紅外譜圖Fig.5 FT-IR spectra of RL and MWL

從圖5可看出,兩種木質素的紅外譜圖極為相似,說明他們含有相似的化學基團。參照文獻[21]對紅外譜圖進行解析。3384 cm-1處峰由O-H伸縮振動產生;2935、2838 cm-1位置的峰由C-H伸縮振動產生;1715 cm-1處峰由C=O伸縮振動產生;1590、1510 cm-1處峰歸屬于木質素中的苯環骨架;1354 cm-1處峰由C-O-C鍵伸縮振動產生;與MWL相比,AEL在1715和1354 cm-1位置的峰很弱,表示AEL中C=O和C-O-C兩種化學鍵含量較少。說明預處理主要破壞了木質素中C=O鍵和C-O-C這兩種化學鍵,其他化學基團得到了較好的保留,回收木質素作為預處理副產物具有較大的應用價值。

2.4.3 掃描電鏡分析 粉碎麥草秸稈原料(RM)與堿醇預處理后秸稈物料(PM)的掃描電鏡觀察見圖6所示,可以看出,粉碎麥草秸稈表面光滑,纖維飽滿,結構組織緊密,表現出明顯的機械剪應力作用后形態。經堿醇預處理后物料,纖維結構變化明顯,變得蓬松、柔軟,表面出現了大量的凹陷和裂痕,這在一定程度上可以增加物料的比表面積,有助于纖維素酶與物料的接觸,改善酶解環境,從而提高了酶解效率。

圖6 麥草原料(RM)和堿醇預處理后物料(PM)的掃描電鏡照片(1000×)Fig.6 Images of SEM from RM and PM(1000×)

3 結論

通過響應面實驗優化后的工藝參數分別為預處理溫度140 ℃、堿質量分數1.19%、預處理時間2.37 h;此時物料酶解總糖轉化率為96.78%,與模擬值96.47%基本一致,表明優化模型有較好可靠性。

在上述最優條件下進行化學組分及掃描電鏡分析,表明堿醇預處理后可有效溶出麥草原料中的木質素,木質素溶出率達84.62%。因木質素的大量溶出,使物料表面出現了大量的凹陷和裂痕,物料比表面積增加,有助于纖維素酶與物料的接觸,改善酶解環境,從而提高酶解效率。堿醇木質素的FT-IR表征表明,預處理使木質素中部分C=O鍵和C-O-C鍵發生斷裂。與原料磨木木素相比,回收木質素中除C=O鍵和C-O-C鍵含量減小外,其他基團得到了較好的保留,回收木質素作為預處理副產物具有較大的應用價值。