響應面法優化脂肪酶水解紅花籽油工藝

呂凱波

(武漢工商學院環境與生物工程學院,湖北武漢 430065)

紅花(CarthamustinctoriusL.)是著名的藥用植物和新興的優良油料作物[1]。紅花籽油又稱紅花油,是以紅花籽為原料加工得到的油品,因富含不飽和脂肪酸作為食療藥物、保健食油而備受關注[2-3]。各地紅花籽油成分略有差異,含量在79.17%～91.27%[4]。我國《紅花籽油國家標準》(GB/T 22465-2008)中明確規定紅花籽油脂肪酸組成中亞油酸(C18∶2)67.8%～83.2%、油酸(C18∶1)8.4%～21.3%[5],可見紅花籽油中不飽和脂肪酸種類與含量是油品營養價值的關鍵[6]。

近年來關于富集紅花籽油中亞油酸的較多[7],如通過尿素包合法富集紅花籽油中亞油酸[8],并對包合條件進行研究探討,得到亞油酸純度為98.55%,得率為73.05%[9-10]。但因為需要甲醇溶液作為溶劑,有一定殘留,會影響食用安全性。脂肪酶水解油脂制備脂肪酸具有條件溫和、產品質量好、能耗低和環境污染小等優勢,目前酶法已成功應用于紫蘇籽油[11]、花椒油[12]、橄欖油[13]、茶葉籽油[14]等制備不飽和脂肪酸的研究報道較多,對酶解紅花籽油制備方面的研究尚未見報道。

本研究選用不同脂肪酶水解紅花籽油,通過響應面對水解條件進行優化,為紅花籽油及亞油酸的開發應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅花籽 長約5 mm產地新疆，武漢谷羽堂生物科技有限公司提供;胰脂肪酶(24.4 U/g) 梯希愛化成工業發展有限公司;米曲霉脂肪酶(300000 U/g) 阿拉丁公司;假絲酵母脂肪酶(10000 U/g) 北京高瑞森科技有限公司代理銷售;CALB脂肪酶(5000 U/g) 北京高瑞森科技有限公司代理銷售;無水乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

DG120型粉碎機 浙江省瑞安市飛達藥材器械廠;RE52CS型旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;KK28F58TI型直冷式冷藏冷凍箱 博西華家用電器有限公司;DZKW-D-2型恒溫水浴鍋 北京市永光明醫療儀器有限公司;pHS-3C型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅花籽油的提取 參考文獻[15],采用石油醚提取,在超聲時間為20 min、料液比為 1∶9 (g/mL)、超聲溫度為35 ℃條件下進行提取。

1.2.2 紅花籽油的酶解及水解率的計算 將所需配比的紅花籽油、脂肪酶和磷酸鹽緩沖液加入50 mL錐形瓶中并混勻,調節水浴鍋中水浴溫度,在攪拌速度300 r/min條件下酶解一定時間。對紅花籽油水解產物進行酸值和皂化值的測定,并按照如下公式計算水解率[16]。

水解率(%)=(AVX-AV0)/(SV-AV)×100

式中:AVX為水解后樣品的酸值;AV0為空白對照酸值;AV、SV分別為原料紅花籽油的酸值和皂化值。

1.2.3 脂肪酶的篩選 按1.2.1方法提取的紅花籽油,按照表1的方法在最適條件下水解,以水解率作為評定指標,確定最佳的脂肪酶。

表1 不同脂肪酶酶解條件Table 1 Different conditions of enzymatic hydrolysis of Lipase

1.2.4 單因素實驗 在初始pH為7.0,酶解溫度36 ℃,酶解時間10 h的情況下,考察不同酶添加量(180、240、300、360、420 U/g)對水解率的影響;在初始pH為7.0,酶解時間10h,酶添加量為300 U/g,考察不同溫度(30、33、36、39、42 ℃)對水解率的影響;在酶解溫度36 ℃,酶解時間10h,水油比酶添加量為300 U/g的情況下,考察不同初始pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)對水解率的影響;在初始pH為7.0,酶解溫度36 ℃,酶添加量為300 U/g,考察不同酶解時間(5、10、15、20、25 h)對水解率的影響。

1.2.5 響應面優化設計 在單因素實驗的基礎上,每個因素選取三個對水解率影響較大的水平,建立三因素三水平中心組合實驗,以水解率為響應面,各因素的水平用-1、0、1進行編碼,如表2。

表2 響應面設計因素水平表Table 2 Response surface design factor level

1.3 數據處理

取單因素實驗結果的三次實驗平均值和標準偏差,響應面結果采用Design Expert軟件處理。

2 結果與分析

2.1 脂肪酶的篩選

四種脂肪酶按表1在各自最適溫度及pH條件下水解紅花籽油后,測定不飽和脂肪酸水解率,結果如圖1所示。

圖1 不同脂肪酶對水解率的影響Fig.1 Effect of different lipases on hydrolysis rate

由圖1可知,酶用量相同的條件下,假絲酵母脂肪酶與米曲霉脂肪酶對油脂水解效果較好,不飽和脂肪酸的水解率分別為86.94%和86.75%。但假絲酵母脂肪酶費用較高,為了節約成本合理利用資源,故選擇米曲霉脂肪酶作為最佳水解酶。

2.2 單因素實驗

2.2.1 酶添加量對水解率的影響 由圖2可知,酶用量在180～300 U/g時,水解率隨著酶加量的增加而在不斷地提高,酶添加量為300 U/g時達到最大值83.04%,之后水解率呈遞減的狀態。其原因在于酶催化油脂水解達到飽和后會發生逆反應催化甘油酯的合成,從而降低了水解率[19]。故單純提高酶添加量水解也不會提高,甚至造成了米曲霉脂肪酶的浪費。與Mucor javanicus脂肪酶(MJ)[16]水解火麻油最適酶添加量 952 U/g相比,米曲霉脂肪酶酶水解效率提高。綜合考慮選擇酶添加量250、300、350 U/g進行響應面優化實驗。

圖2 酶添加量對水解率的影響Fig.2 Effect of amounts of lipases on hydrolysis rate

2.2.2 酶解溫度對水解率的影響 由圖3可知,溫度低于39 ℃時,水解率隨著溫度的升高逐漸增大,高于39 ℃水解率反而迅速下降。因為米曲霉脂肪酶的最適溫度為39 ℃,溫度持續升高超過其最適溫度,使酶活降低,甚至導致酶變性,部分或全部失去催化活性,與甘爭艷等[21]脂肪酶催化紅花油水解反應溫度結論一致。故選擇39 ℃左右做為米曲霉脂肪酶水解最佳溫度。

圖3 溫度對水解率的影響Fig.3 Effect of temperature on hydrolysis rate

2.2.3 pH對水解率的影響 由圖4可知,pH在4.0～7.0時,不飽和脂肪酸水解率隨著pH的增高而增加,pH高于7.0后水解率呈下降趨勢,因為隨著pH持續增加超過了米曲霉脂肪酶的最適pH,使酶活降低,甚至導致酶變性,故選擇pH7.0左右做優化范圍。與甘爭艷脂肪酶催化紅花油水解反應pH7～8之間較適宜結論一致[21]

圖4 pH對水解率的影響Fig.4 Effect of pH on hydrolysis rate

2.2.4 酶解時間對水解率的影響 由圖5可知,在5～15 h時,隨著時間的延長，水解率逐漸增加,但15 h后水解率呈下降趨勢。說明隨著酶解時間的增加,底物不斷消耗,酶解充分,但反應時間過長油脂與空氣接觸時間增加,容易氧化影響油脂品質,從而造成能源和資源浪費。這與當反應時間達到17 h后,茶葉籽油水解反應基本完成或接近平衡狀態現象一致[14]。同時由圖5可知,反應進行到10 h之后水解率趨于平緩,所以選取反應時間10 h作為脂肪酶條件的優化研究。

圖5 酶解時間對水解率的影響Fig.5 Effect of time on hydrolysis rate

2.3 響應面實驗

采用Design Expert軟件程序,根據表2設計響應面實驗,結果分析見表3。

表3 響應面實驗結果Table 3 Data of response surface experiment

根據表3的數據進行回歸分析,得到回歸方程:水解率(%)=89.29+0.015A+7.500E-0.03B+0.39C-1.18AB+0.065AC-0.14BC-1.17A2-2.38B2-1.54C2。對模型進行方差分析,結果見表4。

表4 回歸模型及方差分析Table 4 Analysis of variance of regression equation

回歸方程模型的R2=0.9036,由方差分析得到p為0.0079(p<0.05),說明該模型擬合性能較好,實驗方法可靠;失擬項不顯著(p>0.05),說明所得方程與實際擬合中非正常誤差所占比例小。其中，溫度二次項(B2)、pH二次項(C2)對響應值影響極顯著(p<0.01);酶加量與溫度交互項(AB)、酶加量二次項(A2)對響應值影響顯著(p<0.05),各影響因素對響應值影響性的排序為酶解pH(C)>酶加量(A)>溫度(B)。

等高線圖越接近橢圓表示交互作用越顯著，響應面曲圖的坡度越陡，則該因素對水解率的影響越大。圖6表明，AB因素交互作用等高線呈橢圓形，坡度較大；AC次之；BC較圓，坡度較大，這與回歸模型的方差分析結果相符，即AB交互作用大于AC、BC[20]。

圖6 響應面交互作用影響Fig.6 The response surface graph of interaction effect on hydrolysis rate

2.4 驗證實驗

按照響應面設計實驗數據最佳水解率工藝為:酶添加量為301.09 U/g,酶解溫度為39.03 ℃,pH為7.01,預測水解率最大值為89.29%。選取最高值為驗證實驗基礎,考慮到實驗的可操作性,將工藝條件優化為:酶加量300 U/g、溫度39 ℃、pH7.0、酶解10 h。實驗設計中心點與響應面優化理論值相近,進一步說明選擇的中心點是實驗比較重要的數據中心,并通過響應面實驗證實了數據的可靠。平行實驗測得酶解率分別為89.16%、89.31%和89.54%,平均值達到89.37%±0.19%,理論預測值偏差小,說明響應面法得到的提取條件可靠。

3 結論

采用響應面法對米曲霉脂肪酶脂解紅花籽油的工藝參數進行優化,在酶加量300 U/g、溫度39 ℃、pH7.0、酶解10 h條件下紅花籽油的平均水解率達到89.37%±0.19%,證明酶法制備脂肪酸是一項高效的提取技術,本研究為其他動植物油脂酶法制備脂肪酸提供了參考。