油茶餅粕多糖的分級及其抗氧化性評價

石 浩,何小娥,黃衛文,胡玉玲,樊紹剛,王文龍,*

(1.湖南應用技術學院農林科技學院,湖南常德415100;2.湖南農業大學園藝園林學院,湖南長沙 410128)

油茶(CamelliaoleiferaAbel.)屬油茶屬茶科,常綠小喬木[1-2],主要種植在湖南、江西兩省,占據全國總種植面積的60%以上[3]。在獲取茶油的同時,每年油茶餅粕的產量也十分巨大,目前年產量已高達40萬噸以上,多年來它被作為一種“廢棄物”,而常常被人忽視[4-5]。目前國內油茶餅粕大部分被用作物肥料及動物飼料的原材料中,很少有做進一步的開發利用,油茶餅粕中含有一定量的代謝產物,其中多糖類含量高達30%以上。多糖作為油茶餅粕中的主要物質,具有一定的保健作用,如提高免疫力[6]、抗氧化、抗衰老[7-9]、降血糖[10]、抗腫瘤等[7,11]。因此,對油茶餅粕中多糖類物質的利用與活性研究是非常具有必要性的。

生態環境日益嚴重的污染以及人類精神、物質生活壓力的增加,都將直接或間接導致人體內自由基含量的增加。由于自由基屬于體內的一種高能分子,也破壞細胞膜,降低細胞活性,加速細胞內沉積物的生成,常會引發一些心腦血管病、癌癥等高發的慢性疾病[12-13],因此對油茶餅粕多糖清除自由基活性方面的研究,以及開發相應清除自由基的保健品尤為重要。近年來,國內外在多糖清除自由基方面的研究比較多[14],但對其純化多糖與其他物質協同抗氧化作用的研究較少。有相關報道稱[15],有些復合劑活性相比單一藥劑,具有活性高、成本低等優點,為避免高劑量帶來的食品安全問題,有很好的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油茶餅粕 湖南省常德市丁家港鎮油茶果經榨取茶油后所得副產物;DEAE-52纖維素、Sephadex G-100葡聚糖凝膠、DPPH自由基、木瓜蛋白酶(酶活≥60萬U/g) Sigma公司;Dextran T-10、T-40、T-100、T-200、T-500系列標準多糖 Solarbio公司;VE、VC、氯化鈉、無水乙醇、丙酮、正丁醇、氯仿、葡萄糖、98%濃硫酸、苯酚、氫氧化鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵、鄰苯三酚、鹽酸、水楊酸、硫酸亞鐵、雙氧水、Na2HPO4、NaH2PO4國藥集團化學試劑有限公司;有機試劑 均為分析純。

THZ-92B型可調速控溫搖床 上海浦東物理儀器廠;ZW1105051705型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;SB-3200D型超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;AUW220D型電子天平 日本shimadzu公司;DR-1001型旋轉蒸發儀 鄭州長城科工貿有限公司;TG16型臺式高速離心機 長沙英泰儀器有限責任公司;DK-98-IIA型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;Thermo Savznt冷凍干燥儀 上海智巖科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多糖供試液的制備 取10 g油茶餅粕粉末經3.0%木瓜蛋白酶反應3.0 h后,75 ℃熱水(1∶30 (g∶mL))、1000 W超聲提取,提取3次,每次45 min[17]。抽濾棄去渣,合并濾液,提取液經濃縮至30 mL左右,加入1/3體積的Sevag試劑[氯仿∶正丁醇=4∶1 (V∶V)],混合振蕩15 min后,靜置10 min,除去水層與溶劑交界處的變性蛋白質。濾液經60 ℃減壓蒸餾濃縮至15 mL體積后,加入最終濃度為75%的乙醇,沉淀得粗多糖。粗多糖用20 mL丙酮洗滌多次,得到初步純化多糖溶液,將其濃縮至浸膏狀后,-80 ℃冷凍干燥成粉末,稱重約0.76 g,4 ℃條件下保存備用。

1.2.2 多糖組分的分離純化 取約50 mg/mL的多糖水溶液10 mL,分別相繼上樣于DEAE-52纖維素柱和Sephadex G-100葡聚糖柱進行柱層析,用0.05、0.1、0.3、0.5 mol/L NaCl進行分段梯度洗脫,每個濃度的洗脫體積為90 mL;洗脫流速為1.0 mL/min,收集洗脫液,5 mL/管,采用硫酸-苯酚法顯色跟蹤測定,共分離出5個對稱性較好、純度較高的多糖組分,依次命名為:DTA、DTB、DTC1、DTC2、DTD。合并各多糖組分的洗脫液,采用旋轉蒸發儀濃,經60 ℃減壓縮至浸膏狀;濃縮液經-80 ℃冷凍干燥至粉末狀,測定其含量、純度備用。

1.2.3 多糖含量及純度的測定

1.2.3.1 葡萄糖標準曲線的繪制 移液槍分別精密移取濃度為100 μg/mL的葡萄糖對照品溶液0.15、0.30、0.45、0.60、0.75、1.00 mL于6支20 mL玻璃試管中,加入5.0%苯酚溶液1 mL,并迅速加入濃硫酸5 mL,搖勻,常溫靜置20 min后沸水浴3 min,取出后迅速冷卻至室溫,各試管中加蒸餾水補至10 mL,在490 nm處測定吸光值。精密量取蒸餾水1 mL同上述操作,作為空白對照,以糖濃度為橫坐標(x),吸光值為縱坐標(y)得回歸方程:y=0.0095x+0.0045(R2=0.9993)。

1.2.3.2 多糖含量的測定 取上述所得多糖粉末0.05 g,用蒸餾水溶解至1000倍體積后,取1 mL稀釋液采用硫酸-苯酚法測定多糖含量,經換算得總多糖為0.511 g,其計算公式如下。

多糖含量(mg)=Ci×V×N×10-3

其中,Ci為樣品測定吸光度在標準曲線中對應濃度(μg/mL);V為樣品測定時體積(1 mL);N為樣品稀釋倍數(1000)。

1.2.3.3 多糖純度的測定 粗多糖經層析柱分離后,收集合并含相同組分的洗脫液,濃縮至浸膏狀后,-80 ℃冷凍干燥至粉末,分別稱量和測定各組分多糖的質量,計算純度。

其中,Ai為多糖樣品測定質量(mg);Aj為多糖樣品稱量質量(mg)

1.2.4 多糖分子量范圍的確定 采用葡聚糖柱層析法。將濃度為5 mg/mL的Dextran T-10、T-40、T-100、T-200、T-500系列標準多糖0.1 mL分別相繼上樣,用雙蒸水洗脫,每5 mL一管收集流出液,苯酚-硫酸法顯色,收集合并洗脫液,求得洗脫體積(Ve),用Dextran T-2000同法測得柱床體積V0,以Ve/V0為橫坐標,相對分子質量對數(lgM)為縱坐標,求得回歸方程:y=-0.194x+5.9377(R2=0.9991)。各組分多糖均采用同法上柱得體積Ve′,根據Ve′/V0值代入到標準曲線方程中,求得其相應多糖組分的分子量。

1.2.5 多糖組分抗氧化能力的測定

1.2.5.1 還原能力測定 參照郝旭梅等[18]方法并稍作修改。用移液槍移取1.0 mL不同濃度、不同組分多糖溶液于10 mL玻璃試管中,同時加入1.5 mL濃度為0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH=6.6)以及1.5 mL濃度為1.0%的K3Fe(CN)6溶液,混勻,在55 ℃的水浴鍋中反應25 min后冷水浴冷卻,再加入1.5 mL濃度為10%的三氯乙酸溶液,搖勻振蕩3 min后加入4 mL蒸餾水和0.20%的FeC13溶液0.5 mL,搖勻,充分反應10 min后測定吸光值A700 nm,每個樣品測三次平行,以蒸餾水作為樣品空白對照。

1.2.5.2 羥自由基(·OH)清除力測定 參照景永帥等[19]方法并稍作修改。用移液槍移取1.0 mL不同濃度、不同組分多糖溶液于10 mL玻璃試管中,同時加入1.0 mL濃度為15 mmol/L的FeSO4溶液以及1.0 mL濃度為15 mmol/L的雙氧水溶液,混勻,常溫下反應10 min后加入1.0 mL濃度為15 mmol/L的水楊酸溶液,搖勻,常溫下反應30 min后補加蒸餾水1.0 mL,在510 nm處測定樣品組吸光值Ai,樣品背景吸光值Aj,以及蒸餾水作為樣品空白對照吸光值Ao,每個樣品測三次平行。

1.2.5.4 DPPH自由基清除力測定 參照劉軍軍等[21]方法并稍作修改。稱取適量粗多糖、不同組分多糖及VC與VE,配成不同濃度的溶液。分別取不同濃度溶液1.0 mL,用50%乙醇補加至4.0 mL,再加0.5 mg/mL的DPPH溶液1.0 mL,搖勻,在室溫避光反應30 min后在517 nm波長處測其吸光度Ai;樣品背景吸光值Aj;對照組以等體積50%乙醇代替樣品溶液,測定吸光度A0,計算公式同1.2.5.2。

1.2.6 Isobologram分析法研究多糖與VC、VE的相互作用 以多糖、VC、VE單獨作用的IC50值的比值作為參考,選擇多糖與VE的固定比例(質量濃度比)為1∶1、3∶1、9∶1,多糖與VC的固定比例為1∶1、6∶1、36∶1,按固定比例混合后,以同樣的方法測定其對DPPH自由基的清除能力,計算清除率及復合組的IC50值。

對藥物之間相互作用關系進行統計學分析[22-23]。按如下公式計算IC50add:

式中:R為A、B兩種抗氧化劑單獨應用時的效價比,即R=IC50A/IC50B;P1為抗氧化劑A在復配組中所占的比例;P2為抗氧化劑B在復配組中所占的比例,P2=1-P1。由實驗可以得到復配組實際的IC50 mix值,比較理論上的IC50add和實驗得到的IC50 mix,確定是否存在顯著性差異,若IC50 mix值小于IC50add值,表示相互作用為協同作用。

再計算相互作用指數(γ),常用其來評價協同或拮抗作用的程度。

式中：IC50Amix、IC50Bmix分別為復配組中A、B兩種抗氧化劑的IC50值;IC50A、IC50B分別為A、B兩種抗氧化劑單獨作用時的IC50值。若γ<1,表示相互作用為協同作用,γ值越小說明協同作用越強;若γ>1,表示相互作用為拮抗作用;若γ=1,表示相互作用為相加[24]。

1.3 數據處理

數據采用Origin制圖,各抗氧化指標實驗數據采用SAS 9.0統計軟件進行顯著性分析。圖表中不同小寫字母表示α=0.05顯著性水平,p<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 多糖柱層析洗脫圖譜

取約50 mg/mL的多糖水溶液10 mL,依次上樣于已經預處理好的纖維素柱和葡聚糖凝膠柱,實驗結果由圖1可知,共得到5個對稱性好,無重疊,純度較高的多糖組分,分別命名為DTA、DTB、DTC1、DTC2、DTC3、DTD(其中DTC在葡聚糖凝膠柱中得到進一步分離純化出3個組分)。由此圖1可知油茶餅粕多糖經DEAE-52纖維素和SephadexG-100葡聚糖凝膠柱層析后可得到純度較高的不同多糖組分。

圖1 多糖洗脫曲線圖譜Fig.1 Curve of polysaccharide elution

2.2 多糖組分含量、純度及分子量的確定

各組分多糖的分子量大小均不一樣,且有較大差別;通過柱分離所得多糖組分,計算各組分的含量及純度。實驗結果如表1所示,可看出隨著多糖洗脫體積的增加,多糖的分子量不斷的減小;DTA最先被洗脫出來,分子質量最大,在50萬左右,其后組分DTB、DTC1、DTC2分別被洗脫出來,分子量依次為20萬、10萬、5萬左右,DTD最后被洗脫出來,分子量最小,在4萬左右。各組分多糖的純度差別不大,在80%左右;含量有一定的差異,DTA、DTB、DTC1的含量在25%左右,其余兩個組分在10%左右。

表1 不同組分多糖的確定(n≥3)Table 1 Determination of different components of polysaccharide(n≥3)

2.3 多糖抗氧化能力的測定

2.3.1 還原能力的測定 不同組分及不同濃度下多糖還原性能力的大小有較大的差別,其測定結果如圖2所示,各組分多糖隨著其濃度的增加,還原能力逐漸增強,具有一定的正相關性,在0.2～1.0 mg/mL濃度范圍內,還原力增加了4.3～11.5倍。在(1.0 mg/mL濃度下)不同多糖組分間還原力的大小依次為:DTC1>DTC2>DTA>DTD>DTB,DTC1(0.527)相對于DTB的還原力提高了1.7倍,說明各組分多糖由于其結構以及分子量的不一樣,最終導致其自身還原力也相差較大。因此,在今后對油茶餅粕多糖類抗氧化產品開發時可選擇10萬左右分子量的多糖。

圖2 不同組分多糖的還原力Fig.2 Reducing power of polysaccharides from different components注:圖中不同字母表明差異顯著(p<0.05);圖3～圖6同。

2.3.2 ·OH自由基清除力測定結果 不同組分及不同濃度下多糖對·OH自由基清除力的大小也具有一定的差異,其測定結果如圖3所示,隨著各組分多糖底物濃度的增加,·OH自由基清除能力逐漸增強,在0.1～0.5 mg/mL濃度范圍內,.OH自由基清除能力增加迅速,如DTC1在0.5 mg/mL時清除率增加了60.50%;0.5～1.5 mg/mL濃度范圍內,·OH自由基清除能力增加也較為迅速,但當濃度≥1.5 mg/mL時,·OH自由基清除能力逐漸趨于平穩。在2.0 mg/mL濃度下,不同多糖組分間·OH自由基清除能力的大小依次為:DTC1>DTA>DTC2>DTD>DTB,DTC1(78.92%)相對于DTB提高了31.00%。

圖3 不同組分多糖的·OH自由基清除率Fig.3 Scavenging rate of ·OH radical in different fractions of polysaccharides

圖4 不同組分多糖的超氧陰離子自由基清除率Fig.4 Scavenging rate of superoxide anion radical in different fractions of polysaccharides

2.4 多糖、VC、VE清除DPPH自由基能力的比較

在一定濃度范圍之內,各組分多糖、VC、VE對DPPH自由基的清除能力與濃度呈量效關系,后均逐漸趨于穩定。由圖5、圖6可知,多糖具有較強清除自由基的能力,其中DTC1抑制效果最佳,當其質量濃度達到2.0 mg/mL時,對DPPH自由基的清除率可達到80%以上。多糖(DTC1)、VE、VC的IC50值分別為0.833、0.266、0.135 mg/mL,即清除DPPH自由基的能力依次為VC>VE>多糖。DTC1與VC及VE的IC50值比率分別為1∶0.162、1∶0.319,后續選擇3組固定比例做復配物抗氧化測定。

圖5 不同組分多糖的DPPH自由基清除率Fig.5 Scavenging rate of DPPH radical in different fractions of polysaccharides

圖6 VC、VE的DPPH自由基清除率Fig.6 Scavenging rate of DPPH radical in VC、VE

2.5 Isobologram分析法評價多糖與VC、VE的相互作用

2.5.1 DTC1與VC、VE復配后清除DPPH自由基能力的測定 多糖(DTC1)和VC的固定比例均定為1∶1、6∶1、36∶1,DTC1和VE的固定比例均定為1∶1、3∶1、9∶1,VC、VE固定比例中的質量濃度選擇0.01～0.50 mg/L,DTC1固定比例中的質量濃度選擇0.01～2.50 mg/L較為適宜。以同樣的方法測定復合抗氧化劑對DPPH自由基的清除作用(表2);再由表2計算出多糖與VC、VE組成的復配抗氧化劑對DPPH自由基的清除作用的IC50值(表3)。

表2 DTC1與VC、VE復配后對DPPH自由基的清除能力(n≥3)Table 2 DPPH radical scavenging capacity of DTC1combined with VC or VE(n≥3)

2.5.2 DTC1與VC、VE復配后的統計學分析 按1.2.6所述方法及相應公式計算復配組(表2)理論上的IC50add值和相互作用指數γ,結果見表3。由表3可出,各種組合的IC50 mix值均小于IC50add值,經過t檢驗證明兩者之間有一定差異性,且相互作用指數γ都小于1,表明多糖與VC、VE的相互作用為協同作用。γ值越小說明協同作用越強,由此可得多糖與VC復配組的協同作用略弱于多糖與VE復配組,兩組均是1∶1配比的協同作用效果最好,其次是多糖與VE(1∶36)復配組。

表3 DTC1與VC、VE復配后清除DPPH自由基的IC50值及統計學分析結果Table 3 IC50 value and statistical analysis of DPPH radical scavenging by DTC1 and VC、VE

2.5.3 DTC1與VC、VE復配后的Isobologram分析圖 根據圖5、圖6、表3所測得IC50值標繪在Isobologram分析圖上(圖7、圖8)。將DPPH自由基清除實驗中得到的DTC1的IC50值和95%可信限標繪在縱軸上,VC和VE的IC50值和95%可信限標繪在橫軸上,將兩IC50值相連后構成相加線,將兩可信限分別相連后作出相加線95%可信限。若復合多糖(DTC1)效應(復配點IC50)落在相加效應線上或可信限內,則表示兩藥作用為相加;如落在相加效應線的可信限左側,則代表協同作用;如落于右側,則為拮抗作用。由圖7、圖8可知,復配組的效應點均落在相加線和95%可信限的左側,表明DTC1與VC、VE復配后存在協同抗氧化作用。

圖7 DTC1與VC復配的Isobologram分析圖Fig.7 Isobolographic plot of DTC1 from Camellia cakes combined with VC注:相加線上的空心點(○)代表理論IC50add值,實心點(●)代表實驗IC50 mix值;圖8同。

3 結論

4 討論

多糖組分得到柱分離,以及不同組分多糖抗氧化性差異可能是由于各組分多糖的單糖組成、極性大小、質量大小、黏度大小、空間構象等一些因素不一樣所導致[25-26],在后期實驗中可進一步對不同組分多糖結構的測定,探討其結構、組成與抗氧化能力大小的關系。目前抗氧化劑復配在一起發揮協同作用的機理主要有修復再生或新生、偶聯氧化、吸收氧氣、改變酶的活性、絡合金屬離子等[27-29],影響協同作用強弱的因素主要有兩種物質的平衡濃度及其配比等。今后可在本文的基礎上進行進一步實驗,研究多糖協同抗氧化的具體機理及其發揮最佳協同作用的平衡濃度,從而最大程度上節約成本,更好地指導生產與實踐。