魚膠原蛋白肽對α乳白蛋白和表沒食子兒茶素沒食子酸酯聚集行為的影響及所形成三元復合物的熱穩定性

楊 偉,陳如炎,徐 響,趙 通,李 根,郝一博,王文娟,焦夢婷,張 浩,李 波,*

(1.河南科技學院食品學院,河南新鄉 453003;2.中國農業科學院蜜蜂研究所,北京 100093)

魚膠原蛋白肽(CP)分子量小,具有較高的營養價值和生物活性,能夠100%被人體吸收利用,常用于功能性食品、飲料和化妝品中[1]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是綠茶中的主要活性成分,具有優良的抗菌性和抗氧化活性,被廣泛用作功能食品添加劑,作為藥品或保健品應用于減肥、慢性疾病和亞健康人群中[2-6]。多酚能夠與蛋白質和多肽通過非共價鍵(氫鍵、疏水作用和范德華力等)結合,在一定條件下聚集形成可逆的亞微米復合物[7-8]。這類亞微米復合物一般濁度較大,常被認為是影響葡萄酒、啤酒、黃酒等酒類產品以及茶飲料和果蔬汁飲料感官品質的主要原因[9-12]。

許多因素能夠干擾蛋白質-多酚亞微米復合物的形成[13]。研究表明,果膠、黃原膠和阿拉伯膠等陰離子多糖能夠影響蛋白質和多酚的聚集,其主要機制是在溶液中形成以蛋白質-多酚復合物為核,多糖為殼的“蛋白質-多酚-多糖三者復合物”,通過增加復合物的水溶性而抑制蛋白質-多酚聚集體的形成[14-15]。最新研究表明,除了陰離子多糖外,一些分子量較小的食品功能性因子,如CP,也能夠抑制蛋白質-多酚復合物的形成[16]。Yang等[16]采用三種自組裝順序,研究了CP對乳鐵蛋白(LF)和EGCG所形成濁度的抑制作用,研究發現,CP能夠與吸附在LF表面的EGCG發生競爭,通過形成粒徑較小的LF-EGCG-CP三元復合物而使溶液濁度降低,但LF結構沒有發生顯著變化。α-乳白蛋白(α-La)是一類重要的乳蛋白,作為壁材,能夠包埋、運載、傳遞EGCG[17]。但在一定條件下,α-La能夠與EGCG形成混濁沉淀,進而限制了α-La-EGCG復合物在澄清溶液中的應用。熱處理是許多食品加工中重要的步驟,CP對蛋白質與多酚聚集行為的影響可能受環境因素,尤其熱加工處理的影響。

本文通過測定α-La-EGCG-CP三元復合物的濁度、粒徑、電位、熒光光譜和圓二色譜,在室溫(25 ℃)條件下研究CP對α-La與EGCG聚集行為的影響,并在70 ℃條件下對所形成的三元復合物體系進行熱處理,研究α-La-EGCG-CP三元復合物聚集體結構的熱穩定性,為解決α-La-EGCG復合物在澄清溶液中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚膠原蛋白肽(CP) 純度≥99%,來源于羅非魚魚皮,平均分子量2000 Da,北京盛美諾生物技術有限公司;α-乳白蛋白(α-La) 純度≥95%,美國Agropur公司;表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG) 純度≥98%,美國Sigma公司;其它所用化學藥品 均為分析純。

2100N型濁度計 美國HACH公司;Zetasizer Nano-ZS型激光粒度儀 英國Malvern公司;Cary-Eclipse型熒光分光光度計 美國安捷倫公司;Pistar π-180型圓二色譜 英國應用光物理公司。

1.2 實驗方法

1.2.1α-La-EGCG-CP三元復合物的制備 在10 mmol/L檸檬酸鹽緩沖溶液(pH=3.0)中,分別配制0.6 mmol/Lα-La和5.0 mmol/L的EGCG母液。按三種不同的添加順序制備α-La-EGCG-CP三元復合物，室溫為25 ℃。

處理組1:取2.0 mL 0.6 mmol/L的α-La溶液和1.0 mL 5.0 mmol/L的EGCG溶液,利用渦旋混合器混合(3000 r/min,1 min)均勻,靜置2 h后加入1.0 mL濃度分別為15、22.5、30、45、60、75 mg/mL的CP溶液,繼續混合1 min后靜置2 h。制備的三元復合物記為SATx-1(x=25和70 ℃),SAT25 ℃-1和SAT70 ℃-1分別表示采用第一種添加順序制備的室溫自組裝三元復合物和70 ℃條件下熱處理三元復合物。

處理組2:取2.0 mL 0.6 mmol/L的α-La溶液和1.0 mL濃度分別為15、22.5、30、45、60、75 mg/mL的CP溶液,利用渦旋混合器混合(3000 r/min,1 min)均勻,靜置2 h后加入1.0 mL 5.0 mmol/L的EGCG溶液,繼續混合1 min后靜置2 h。制備的三元復合物記為SATx-2(x=25和70 ℃),SAT25 ℃-2和SAT70 ℃-2分別表示采用第二種添加順序制備的室溫自組裝三元復合物和70 ℃條件下熱處理三元復合物。

處理組3:取1.0 mL 5.0 mmol/L的EGCG溶液和1.0 mL濃度分別為15、22.5、30、45、60、75 mg/mL的CP溶液,利用渦旋混合器混合(3000 r/min,1 min)均勻,靜置2 h后加入2.0 mL 0.6 mmol/L的α-La溶液繼續混合1 min后靜置2 h。制備的三元復合物記為SATx-3(x=25和70 ℃),SAT25 ℃-3和SAT70 ℃-3分別表示采用第三種添加順序制備的室溫自組裝三元復合物和70 ℃條件下熱處理三元復合物。

空白對照組:取2.0 mL 0.6 mmol/L的α-La溶液和1.0 mL 5.0 mmol/L的EGCG溶液,利用渦旋混合器混合(3000 r/min,1 min)均勻,靜置2 h后加入1.0 mL緩沖溶液,繼續混合1 min后靜置2 h。

α-Lax(x=25和70 ℃)分別表示在室溫條件和70 ℃加熱條件下的α-La溶液。

1.2.2 濁度測定 采用2100 N濁度儀測定樣品的濁度。測定溫度為25 ℃。濁度儀采用90°散射光原理,在恒定入射光條件下,散射光強度與溶液的渾濁度成正比。

1.2.3 粒徑和zeta電位(ζ-電位)測定 采用Zetasizer Nano-ZS激光粒度儀室溫分析三元復合物的粒徑大小和ζ-電位,同時用多分散系數(Polydispersity Index,PdI)表示粒徑分布。

1.2.4 熒光光譜測定 采用Cary-Eclipse熒光分光光度計進行熒光光譜掃描,其中激發波長為292 nm,激發縫寬和發射縫寬均為10 nm,記錄熒光強度的變化。

1.2.5 圓二色譜測定 采用Pistar π-180型圓二色譜儀測定三元復合物中α-La的二級結構。取0.4 mLα-La濃度為0.02 mg/mL的樣品于樣品池中,樣品池的光徑為0.1 cm,掃描波長范圍為190～260 nm,溫度為25 ℃,掃描速度為100 nm/min,累計次數3次,記錄CD圖譜。同樣實驗條件下測定檸檬酸鹽緩沖溶液的圓二色譜為空白。根據DICHROWEB的方法計算二級結構的百分含量[18-20]。

1.3 數據分析

每組實驗至少重復兩次,每個樣品至少檢測三組數據,結果用平均值M±標準差SD來表示。運用SPSS 18.0軟件,采用Duncan法對數據進行單因素方差分析,顯著水平為5%。

2 結果與分析

2.1 CP濃度對三元復合物濁度的影響

在10 mmol/L pH3.0檸檬酸鹽緩沖液中,當EGCG濃度為1.25 mmol/L 時,α-La-EGCG復合物的濁度為(604±30) NTU。經70 ℃熱處理后,α-La-EGCG復合物的濁度為(1900±50)NTU,較之25 ℃條件下增加3.15倍左右,這可能與α-La-EGCG復合物的熱聚集有關。

如圖1a所示,采用三種添加順序制備的α-La-EGCG-CP三元復合物,它們濁度隨CP濃度的增加表現出相似的變化規律,即先增大后減小。當CP濃度為15～30 mg/mL時,SAT25 ℃-1濁度略有增加,而SAT25 ℃-2和SAT25 ℃-3濁度增加明顯;當CP濃度為60和75 mg/mL時,SAT25 ℃-1的濁度分別減小了46.5%和76.8%,SAT25 ℃-2的濁度分別減小了32.1%和56.5%,SAT25 ℃-3的濁度分別減小了42.1%和70.7%。換句話說,利用三種添加順序制備的α-La-EGCG-CP三元復合物中,當CP濃度較低時,CP能夠促進不溶性沉淀的形成,而當CP濃度較高時,CP能夠較好的抑制α-La與EGCG不溶性沉淀的形成,使溶液濁度降低,且處理組1最有效。低濃度的CP會增加溶液中不溶性聚集物的形成可能是由于CP能夠吸附在LF-EGCG復合物表面,從而使復合物的粒徑增加,但由于含量較少,不足以溶解復合物,因此,溶液濁度增加。Yang等[16]研究發現,添加CP并沒有使LF和EGCG形成的不溶性聚集物濁度增加,這可能是本文所用的原料和溶液環境與其不同有關。處理組1、處理組2和處理組3制備的溶液濁度隨CP的添加所表現出的不同增強或降低濁度的能力,說明溶液的濁度與α-La、EGCG和CP的添加順序有直接關系。

圖1 CP濃度對SAT25 ℃(a)和SAT70 ℃(b)濁度的影響Fig.1 Influence of CP concentration on the turbidity of SAT25 ℃(a)and SAT70 ℃(b)

SAT70 ℃濁度表現出與SAT25 ℃不同的變化規律:在CP濃度為15 mg/mL時,SAT70 ℃濁度較之SAT25 ℃高;在CP濃度為22.5 mg/mL時,SAT70 ℃濁度與SAT25 ℃差異不明顯;在CP濃度較高(≥30 mg/mL)時,SAT70 ℃濁度較之SAT25 ℃低;同時,SAT70 ℃-1、SAT70 ℃-2和SAT70 ℃-3具有相同的變化規律,均隨CP濃度的增加而減小,且三種處理組所得溶液濁度差異性不明顯(圖1b)。這可能是因為:通過三種添加順序制備的SAT25 ℃因熱的作用(70 ℃,20 min)重新組裝,進而形成結構相同且均一的α-La-EGCG-CP三元復合物。

總之,較高CP濃度條件下,三種處理組制備的SAT25 ℃溶液濁度較小,溶液中α-La-EGCG復合物形成的濁度受到了抑制;處理組1最有效,其次是處理組3和處理組2。熱處理能夠增加α-La-EGCG-CP三元復合物的溶解性。

2.2 CP濃度對三元復合物粒徑的影響

圖2為CP濃度對α-La-EGCG復合物的粒徑和粒徑分布的影響。從圖2可以看出,隨著CP濃度的增加,SAT25 ℃和SAT70 ℃平均粒徑變化規律與濁度基本一致。

圖2 CP濃度對SAT25 ℃(a)和SAT70 ℃(b)粒徑和PDI的影響Fig.2 Influence of CP concentration on the particle size and PDI of SAT25 ℃(a)and SAT70 ℃(b)

對于SAT25 ℃,當CP濃度較低(≤ 45 mg/mL)時,由于CP主要吸附在α-La-EGCG復合物表面,CP的濃度不足以抑制聚集物的形成,因此α-La-EGCG-CP三元復合物粒徑變大,且PDI較大;當CP濃度為75 mg/mL時,SAT25 ℃的粒徑變小(SAT25 ℃-1、SAT25 ℃-2和SAT25 ℃-3分別為(543±78),(506±12)和(954±90) nm,且PDI較小(SAT25 ℃-1、SAT25 ℃-2和SAT25 ℃-3的PDI由0.419分別降至0.017、0.12和0.035),表明溶液中的α-La-EGCG-CP三元復合物分布變得均一。

對于SAT70 ℃,SAT70 ℃的粒徑隨CP濃度的增加而減小。但與SAT25 ℃相比,SAT70 ℃的粒徑較大,推測可能與α-La、α-La-EGCG復合物或α-La-EGCG-CP三元復合物的熱聚集有關。同時,SAT70 ℃-1、SAT70 ℃-2和SAT70 ℃-3的PDI由0.996分別降至0.233、0.182和0.126,表明熱處理使溶液中三元復合物的分布變得均勻。

2.3 CP濃度對三元復合物ζ-電位的影響

ζ-電位是衡量水溶液中復合物穩定性的重要指標。圖3為SAT25 ℃和SAT70 ℃隨CP濃度的增加ζ-電位的變化情況,從中可得,隨著CP濃度的增加,三元復合物溶液的ζ-電位減小,當CP濃度大于45 mg/mL時,三元復合物溶液的ζ-電位接近于0。這與Yang等[16]的相關研究結果不同,這主要與CP所帶電荷不同有關。應當指出的是,盡管溶液的ζ-電位隨著CP濃度的增加而減小,但溶液的濁度減小,穩定性增強,這可能與CP抑制蛋白質-多酚聚集體形成的機理有關。Yang等[16]認為,CP能夠抑制LF-EGCG聚集體的形成,主要是因為CP能夠通過競爭作用和空間位阻干擾LF與EGCG的結合[16]。因此推測,高濃度CP條件下,SAT25 ℃和SAT70 ℃濁度較低但穩定性較高的主要原因可能與CP的競爭作用,尤其是空間位阻作用有關。

圖3 CP濃度對SAT25 ℃(a)和SAT70 ℃(b)ζ-電位的影響Fig.3 Influence of CP concentration on the ζ-potential of SAT25 ℃(a)and SAT70 ℃(b)

2.4 CP濃度對三元復合物熒光強度的影響

α-La分子含有4個色氨酸殘基[21]。如果基團在天然蛋白質的內部,色氨酸峰值可能發生藍移;如果蛋白分子舒展,色氨酸峰值可能發生紅移[22]。通過監測色氨酸發射峰的變化,可以獲取相關的蛋白結構變化和熒光團周圍微環境的變化。

圖4a～圖4c為SAT25 ℃隨著CP濃度的增加熒光光譜變化。隨著CP濃度的增加,SAT25 ℃-1、SAT25 ℃-2和SAT25 ℃-3均發生明顯的熒光淬滅,熒光強度由100%分別降至22.5%、24.6%和23.2%;同時,CP使三元復合物的發射峰發生紅移,分別由361 nm移至376、373和374 nm。這說明α-La與CP之間存在較強的結合能力,CP的加入顯著改變了α-La的結構,α-La分子中色氨酸殘基的微環境發生了顯著變化。因此推測,對于SAT25 ℃,CP與α-La-EGCG之間的相互作用導致α-La結構更加伸展,α-La分子中色氨酸的親水性增強。

圖4 CP濃度對SAT25 ℃和SAT70 ℃的熒光強度(a～f)和熒光強度變化率(g)的影響Fig.4 Influence of CP concentration on the fluorescence intensity (a～f) and fluorescence intensity change rate(g)of SAT25 ℃ and SAT70 ℃

圖4d～f為SAT70 ℃隨著CP濃度增加的熒光光譜變化。α-La-EGCG復合物在70 ℃熱處理較之25 ℃條件下,熒光強度增強,且發生了顯著的藍移,這與熱處理使α-La分子熱變性,結構更加伸展、疏水性增強有關。隨著CP濃度的增加,SAT70 ℃的熒光光譜變化規律與SAT25 ℃相似,即熒光強度明顯降低,發射峰紅移(圖4g)。值的注意的是,SAT70 ℃的熒光淬滅程度較之SAT25 ℃明顯。例如,當CP濃度為75 mg/mL時,SAT70 ℃-1、SAT70 ℃-2和SAT70 ℃-3熒光強度較α-La-EGCG復合物的熒光強度分別降低12.3%、13.4%和12.0%,而SAT25 ℃-1、SAT25 ℃-2和SAT25 ℃-3熒光強度較α-La-EGCG復合物的熒光強度分別降低22.5%、24.6%和23.2%,說明CP在SAT70 ℃中較之在SAT25 ℃中更加接近α-La。因此推測,對于SAT70 ℃,雖然熱處理使α-La-EGCG復合物疏水性增強,但當加入CP后,CP與α-La-EGCG之間的相互作用同樣導致α-La結構更加伸展,α-La分子中色氨酸的親水性進一步增強。

2.5 CP濃度對三元復合物中α-La二級結構的影響

為獲取更多CP引起α-La二級結構變化的信息,采用遠紫外圓二色譜對復合物進行分析。如圖5a所示,在190～260 nm波長范圍內,α-La-EGCG復合物的圓二色譜在208～210 nm處具有較寬的峰,在218～220 nm處具有肩峰。采用DICHROWEB測定α-La二級結構的含量。α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規則卷曲通過CDSSTR進行測定,結果如圖5b所示。

圖5 α-La-EGCG二元復合物和α-La-EGCG-CP三元復合物(EGCG含量為1.25 mmol/L)遠紫外圓二色譜圖(a)和二級結構含量(b)Fig.5 Far-UV circular dichroism spectra of α-La-EGCG binary complex and α-La-EGCG-CP ternary complex (EGCG content 1.25 mmol/L)(a) and secondary structure content(b)

在α-La-EGCG復合物(EGCG含量為1.25 mmol/L)中,α-La含有29%α-螺旋、20%β-折疊、22%β-轉角和30%無規則卷曲。而在SAT25 ℃中,α-La含有較多的α-螺旋(42%),β-折疊、β-轉角和無規則卷曲均減小,這可能與CP與α-La的結合有關。CP的添加引起了α-La二級結構的改變。該結果與熒光光譜結果一致。

SAT70 ℃中α-La的結構與SAT25 ℃中的大致相同,僅β-折疊和β-轉角減小1%,而無規卷曲含量增加2%。由此推之,熱處理對α-La-EGCG-CP三元復合物中α-La的結構略有影響。

CP對α-La-EGCG聚集物可能的抑制機制是:當CP濃度較低時,不足以抑制α-La-EGCG聚集體的形成,而主要吸附在α-La-EGCG聚集物表面,因此復合物粒徑較大,PDI較大;當CP濃度較高時,CP能夠通過競爭作用或空間位阻破壞EGCG對α-La的橋聯作用,從而形成粒徑和粒徑分布較小的三元復合物。熱處理能夠使復合物(α-La-EGCG復合物和/或α-La-EGCG-CP復合物)中的α-La變性聚集,進而使復合物的粒徑增大。

3 結論

當CP濃度較低時,主要通過吸附機制形成粒徑較大的不溶性α-La-EGCG-CP三元復合物,而當CP濃度較高時,主要通過競爭機制或空間位阻效應,形成粒徑較小的α-La-EGCG-CP三元復合物。CP對復合物粒徑和濁度的影響取決于α-La、EGCG和CP的添加順序。熱處理能夠進一步減小α-La-EGCG-CP三元復合物的濁度。總之,CP干擾α-La與EGCG聚集的能力及所形成三元復合物的熱穩定性,能夠為α-La-EGCG復合物在澄清溶液中的應用提供理論基礎。