熱變性對(duì)海參腸酶解物活性的影響

姜 卉,金文剛,許景光,吳海濤,王笑涵,商文慧,韓佳潤(rùn),唐 越,*

(1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心,遼寧大連 116034;2.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西漢中 723001)

海參(Stichopusjaponicas)屬棘皮動(dòng)物門(mén),海參綱,是一類(lèi)重要的海洋無(wú)脊椎動(dòng)物。海參是一種傳統(tǒng)的海洋來(lái)源食品,同時(shí)也是重要的藥物資源,深受亞洲各國(guó)消費(fèi)者的喜愛(ài)[1]。相關(guān)研究表明,海參體內(nèi)含有較多如多糖[2]、皂苷[3]、萜甙[4]、脂肪酸[5]、多肽[6]等利于人體健康的成分,具有抗炎、抗過(guò)敏[3]、抗真菌[4]、提高免疫力[5]、降血壓[6]、延緩衰老和防治腫癌[7]等作用。

海參制品主要以海參體壁為加工對(duì)象,海參腸大多數(shù)被直接丟棄,不僅對(duì)環(huán)境造成了污染,還浪費(fèi)了蛋白質(zhì)資源,附加值較低[8]。隨著人們對(duì)海洋生物資源認(rèn)識(shí)的提高,從海洋中獲得食品蛋白質(zhì)和生物活性物質(zhì),利用酶制劑加工海產(chǎn)品副產(chǎn)物,制備蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物和多肽,獲得功能性食品原料等,已成為各國(guó)進(jìn)行海洋資源開(kāi)發(fā)利用的重要項(xiàng)目[9],例如非洲鯰魚(yú)抗菌肽[10],巴沙魚(yú)皮血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽[11]等,相關(guān)研究還討論了預(yù)處理對(duì)鳙魚(yú)水解產(chǎn)物抗氧化活性的影響[12],但對(duì)于海參腸活性肽的研究仍屬少數(shù)。

本課題組前期已對(duì)海參腸進(jìn)行了一定的研究,主要集中在對(duì)海參腸中各種酶類(lèi)進(jìn)行分離純化,如β-1,3-葡聚糖酶[13],溶菌酶[14],海參自溶酶[15]和組織蛋白酶B[16]等,探究多種海參腸內(nèi)源酶的特性及其對(duì)海參自溶的影響,但并未研究外源酶對(duì)海參腸的影響。本研究以海參腸為原料,結(jié)合熱變性預(yù)處理,選用中性蛋白酶對(duì)其進(jìn)行酶解,制備海參腸活性多肽,為海洋來(lái)源生物活性物質(zhì)的進(jìn)一步擴(kuò)展研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海參腸 大連長(zhǎng)興水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng);中性蛋白酶(酶活370000 U/g) 南寧龐博生物制藥有限公司;Sephadex G-25葡聚糖凝膠 Pharmacia公司;還原型谷胱甘肽(GSH)、肽分子量標(biāo)準(zhǔn)品:18肽(2342 Da) 西安聯(lián)美生物科技有限公司;維生素B12(1355 Da)、N-Hippuryl-His-Leu(430 Da) Sigma公司;細(xì)胞色素C(12500 Da)、抑肽酶(6512 Da) 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;其余試劑 為國(guó)產(chǎn)分析純。

KDN-103F型自動(dòng)定氮儀 上海纖檢儀器有限公司;SZF-106A型粗脂肪測(cè)定儀 上海新嘉電子有限公司;pHS-3C型精密pH計(jì) 上海雷磁儀器廠(chǎng);P230p型高效液相色譜 大連依利特分析儀器有限公司;UV2100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司;SuperdexTM Peptide 10/300GL凝膠柱(10 mm×300 mm) GE Healthcare公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海參腸化學(xué)組成分析 將海參腸洗凈后勻漿,取部分勻漿液凍干,對(duì)勻漿液(濕基)和海參腸凍干粉(干基)分別采用常規(guī)干燥法、凱氏定氮法、索氏提取法測(cè)定海參腸樣品的水分、蛋白質(zhì)以及脂肪含量[17],采用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量[18],參照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn):y=0.0126x-0.0182(R2=0.9928)進(jìn)行分析;還原糖含量采用DNS法測(cè)定,參照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn):y=0.001x+0.001(R2=0.9994)進(jìn)行分析;繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)品均為葡萄糖。

1.2.2 酶解物制備 海參腸經(jīng)勻漿處理,加去離子水使其質(zhì)量濃度為4%(w/v),沸水浴10 min(變性處理組),實(shí)驗(yàn)中以未經(jīng)沸水浴處理的樣品為對(duì)照(未變性處理組)。根據(jù)課題組的前期研究[19],選用中性蛋白酶為外源酶,變性處理和未變性處理兩組分別用HCl和NaOH溶液調(diào)pH至7.0后,加酶(3000 U·g-1pro.)在50 ℃水浴條件下,兩組樣品均恒溫酶解3 h,沸水浴10 min滅酶,4000 r/min離心15 min后取上清液,-25～-50 ℃條件下真空冷凍干燥60～72 h。

1.2.3 水解度測(cè)定 參照pH-stat法[20],通過(guò)控制標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的滴加量進(jìn)行水解度的測(cè)定,取水解5、10、20、40、60、80、100、130、160、180 min的樣品,記錄對(duì)應(yīng)的NaOH溶液消耗量,計(jì)算水解度,公式如下:

式中:DH-水解度,%;B-滴定過(guò)程消耗堿液量,mL;Nb-堿的當(dāng)量濃度,mol/L;Mp-底物中蛋白總量,g;htot-底物蛋白質(zhì)中肽鍵總數(shù),mmol/g,計(jì)算時(shí)取值為7.5;α-水解過(guò)程中α-氨基的解離度。

1.2.4 酶解液中可溶蛋白、三氯乙酸(TCA)可溶性寡肽含量和肽得率的測(cè)定 將經(jīng)變性預(yù)處理和未變性處理的海參腸酶解液去離子水稀釋20倍后,選用考馬斯亮藍(lán)G-250法對(duì)兩組海參腸酶解液的可溶性蛋白含量進(jìn)行測(cè)定[18],通過(guò)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行計(jì)算。采用TCA沉淀法結(jié)合Folin-酚法檢測(cè)酶解液中TCA可溶性寡肽的含量[21],根據(jù)繪制的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y=0.0035x+0.00128(R2=0.9977),參照文獻(xiàn)[21]對(duì)肽得率進(jìn)行計(jì)算,公式如下:

式中:N1-酶解液中TCA可溶性寡肽含量,mg;N0-酶解液總蛋白量,即酶解液中底物蛋白量,mg。

1.2.5 海參腸酶解液層析分離 采用Sephadex G-25凝膠層析柱(1.6 cm×50 cm),海參腸酶解液上樣量0.5 mL,用去離子水進(jìn)行洗脫,流速為0.25 mL/min,采用部分收集器每次收集40管,作為待測(cè)樣品。

1.2.6 樣品蛋白質(zhì)含量及還原能力的測(cè)定 蛋白含量的測(cè)定采用紫外分光光度法,測(cè)定其在280 nm下的吸光度(OD280)[22]。還原能力的測(cè)定參照文獻(xiàn)[22]進(jìn)行:取層析分離收集到的樣品溶液1 mL,經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)后測(cè)定OD700,空白組為去離子水。

1.2.7 變性處理組樣品分子量分布的測(cè)定 將變性處理組海參腸酶解液用去離子水稀釋5倍,經(jīng)0.45 μm微孔膜過(guò)濾,采用Superdex Peptide 10/300GL(10 mm×300 mm)凝膠過(guò)濾色譜柱進(jìn)行高效液相色譜法測(cè)定分子量分布范圍。具體方法參考文獻(xiàn)[22]進(jìn)行:進(jìn)樣量:50 μL;檢測(cè)波長(zhǎng):220 nm;洗脫流量:0.5 mL/min。分子量標(biāo)準(zhǔn)品分別選用Cytochrome C(12.5 kDa),Aprotinin(6.512 kDa),18肽(2.342 kDa),Vitamin B12(1.355 kDa)和N-Hippuryl-His-Leu(0.43 kDa)和gly-gly(0.132 kDa)。對(duì)凝膠過(guò)濾色譜而言,分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)(y)與保留時(shí)間(x)呈線(xiàn)性關(guān)系,從而得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y=-0.0834x+5.7554(R2=0.9944),計(jì)算海參腸酶解液的分子量分布。

1.2.8 變性處理組海參腸多肽的ABTS+自由基清除率檢測(cè) 以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。具體操作步驟如下:準(zhǔn)確稱(chēng)量0.05006 g Trolox,加入40 mL磷酸鹽緩沖溶液(0.2 mol/L,pH7.4)。將其用PBS(0.2 mol/L,pH7.4)稀釋,使?jié)舛忍荻葹?0、1、2、3、4、5 mmol/L,分別取10 μL與稀釋好的1 mL ABTS+·溶液在30 ℃干浴器中反應(yīng)6 min,在734 nm下測(cè)定吸光值,所得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=19.008x-3.5205。將兩組樣品的凍干粉用去離子水復(fù)溶,配制成濃度為5、10、20、50、100 mg/mL的樣液,檢測(cè)方法同上,樣品濃度梯度為5、10、20、50、100 mg/mL,并將結(jié)果換算為T(mén)rolox當(dāng)量。以還原型谷胱甘肽(5 mg/mL)為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.9 變性處理組海參腸多肽的DPPH自由基清除率檢測(cè) 分別取200 μL濃度為5、10、20、50、100 mg/mL的去離子水復(fù)溶后的樣液與磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mol/L pH6.0)400 μL、DPPH(0.04 g/L)400 μL混勻后室溫避光反應(yīng)30 min,離心(2000×g,10 min),取上清液測(cè)定其在517 nm下的吸光值。以還原型谷胱甘肽(5 mg/mL)為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行顯著性分析,p<0.05時(shí)具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 海參腸主要化學(xué)組成

經(jīng)測(cè)定,海參腸原料水分含量為88.13%±0.06%,干物質(zhì)中粗蛋白、粗脂肪、總糖、還原糖及灰分含量見(jiàn)表1。

表1 海參腸主要化學(xué)組成Table 1 Main chemical composition of Stichopus japonicas guts

由表1可見(jiàn),海參腸中粗蛋白含量高于其他主要化學(xué)成分,所占比例超過(guò)干基的70%。其次為粗脂肪與總糖,灰分含量最低。劉小芳等[23]研究表明,乳山刺參體壁和內(nèi)臟的粗蛋白含量分別為49.75%、34.90%,均低于70%,因此,本研究的海參腸是一種具有開(kāi)發(fā)利用潛力的高價(jià)值蛋白資源。

2.2 海參腸酶解物的水解曲線(xiàn)

對(duì)海參腸進(jìn)行變性預(yù)處理,以未變性組為對(duì)照,在酶解過(guò)程中水解度隨水解時(shí)間的變化如圖1所示,在整個(gè)水解過(guò)程中,兩組海參腸在酶解前30 min內(nèi)水解度上升較快,隨后增加趨勢(shì)平緩,變性組至160 min達(dá)到平穩(wěn)期,隨后變化無(wú)顯著差異,此時(shí)其水解度達(dá)到37.28%,而未變性處理組的水解度至45 min達(dá)到23.76%,且與之后的水解度無(wú)顯著性差異。由此可知,采用中性蛋白酶水解海參腸效果良好,并且底物經(jīng)變性處理后,水解度是未變性組的1.57倍,原因可能是經(jīng)變性處理后,海參腸蛋白的二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞,導(dǎo)致中性蛋白酶與蛋白質(zhì)酶切位點(diǎn)間相互作用,有利于酶解過(guò)程的進(jìn)行[24],這與金文剛等[21]發(fā)現(xiàn)的蝦夷扇貝生殖腺經(jīng)熱變性處理后,其水解度增大的結(jié)果一致。

圖1 海參腸酶解液水解度曲線(xiàn)Fig.1 Hydrolysis degree curve of Stichopus japonicas guts hydrolysates

2.3 海參腸酶解液的可溶蛋白含量、TCA可溶性寡肽含量及肽得率

兩組海參腸酶解液中可溶蛋白含量、TCA可溶性寡肽含量及肽得率結(jié)果見(jiàn)表2,由表2可知,可溶性蛋白含量均低于TCA可溶性寡肽,這主要是因?yàn)榭捡R斯亮藍(lán)G-250法檢測(cè)到的可溶性蛋白為大分子量體系,海參腸經(jīng)過(guò)酶解后體系中的大分子量蛋白大部分被分解為小分子的可溶性寡肽,從而導(dǎo)致體系中TCA可溶性寡肽含量較多;變性處理組海參腸酶解液中可溶性蛋白含量低于未變性組,這是由于變性處理組海參腸酶解程度比未變性處理組高,蛋白質(zhì)水解為小分子肽,從而表現(xiàn)為變性處理組TCA可溶性寡肽含量和肽得率均顯著高于未變性組(p<0.05)。與未變性組相比,海參腸變性處理后TCA可溶性寡肽含量和肽得率分別提高了95%和80%,表明以中性蛋白酶酶解海參腸,變性處理所得的水解液具有較高的可溶性寡肽含量及肽得率。這與金文剛等[25]發(fā)現(xiàn)的蝦夷扇貝性腺蛋白經(jīng)100 ℃加熱處理10 min后,更易于酶解的結(jié)果一致。

表2 海參腸酶解液中可溶性蛋白、TCA可溶性寡肽含量及肽得率Table 2 Content of soluble protein,TCA-soluble oligopeptide and peptide yield of Stichopus japonicas guts hydrolysates

表3 變性處理組海參腸多肽的分子量分布結(jié)果Table 3 Results of molecular weight distribution of Stichopus japonicas guts peptides(denaturated)

2.4 海參腸多肽的分離及還原能力監(jiān)測(cè)

利用Sephadex G-25凝膠柱進(jìn)一步將海參腸變性處理和未變性處理組的酶解液進(jìn)行層析分離,并監(jiān)測(cè)其還原能力,結(jié)果見(jiàn)圖2。兩組海參腸酶解液經(jīng)層析分離后,主要出現(xiàn)兩個(gè)蛋白峰,都具有一定的還原能力,其中未變性處理組洗脫液在280 nm下吸光值分別在第11、20管出現(xiàn)峰值,而變性處理組洗脫液在第9、16管出現(xiàn)峰值,表明變性處理使海參腸多肽分子量的分布向較小分子量方向偏移,此外,相應(yīng)峰值的升高表明經(jīng)熱變性后,其對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)的回收率提高,并且樣品在700 nm下的吸光值表明其同樣具有一定的還原能力,其原因可能在于,高溫預(yù)處理使蛋白質(zhì)的螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生松散,暴露出了更多的蛋白酶結(jié)合位點(diǎn),從而更加利于蛋白質(zhì)和蛋白酶結(jié)合[24],進(jìn)而得到了更多的小分子肽,影響其還原能力。比較變性與未變性組凝膠分離曲線(xiàn)可見(jiàn),海參腸變性處理組酶解液組分相對(duì)比較均一,分子量比較集中,推測(cè)其與蛋白酶的充分結(jié)合作用會(huì)使海參腸蛋白分子裂解得更為徹底,使整個(gè)體系的分子量趨于均一[24]。

圖2 海參腸酶解液經(jīng)Sephadex G-25凝膠柱層析分離及還原能力Fig.2 Reducing avtivity and separation of Stichopus japonicas guts hydrolysates by Sephadex G-25 chromatography

2.5 變性處理組海參腸多肽的分子量分布

由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知變性處理組海參腸多肽的還原能力較高,因此對(duì)其分子量分布進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)圖3。以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)作為參照,根據(jù)變性處理組海參腸多肽的保留時(shí)間以及峰面積,分析可知,該組海參腸多肽的分子量分布范圍主要集中于0.5～3 kDa,占水解液的57.29%,進(jìn)一步說(shuō)明熱變性處理能使海參腸更加充分地與酶反應(yīng),利于酶解。金文剛等[25]對(duì)蝦夷扇貝雌性生殖腺進(jìn)行熱變性處理,酶解后分子量集中于0.25～5 kDa,與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相似。

圖3 變性處理組海參腸多肽的分子量分布Fig.3 Molecular weight distribution of Stichopus japonicas guts peptides(denaturated)

2.6 變性處理組海參腸多肽的ABTS+自由基清除率檢測(cè)

檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4,海參腸多肽的ABTS+自由基清除率呈現(xiàn)明顯的劑量依賴(lài)性,在濃度低于20 mg/mL時(shí),其對(duì)ABTS+自由基的清除效果均隨濃度的提高顯著增加(p<0.05),最高達(dá)到0.51 Trolox equi/μL Sample,與袁坤山等[26]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近。但是在5 mg/mL濃度下其清除率為0.25 Trolox equi/μL Sample低于GSH(0.51 Trolox equi/μL Sample)。結(jié)果表明,變性處理組海參腸多肽確實(shí)具有一定的ABTS+自由基清除能力。

圖4 變性處理組海參腸多肽的ABTS自由基清除率Fig.4 ABTS free radical scavenging rate of Stichopus japonicas guts peptides(denaturated)注:小寫(xiě)字母表示兩組具有顯著差異(p<0.05);圖5同。

2.7 變性處理組海參腸多肽的DPPH自由基清除率檢測(cè)

檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5,海參腸多肽的DPPH自由基清除率在濃度低于20 mg/mL時(shí)呈現(xiàn)明顯的劑量依賴(lài)性,其對(duì)DPPH自由基的清除效果均隨濃度的提高顯著增加(p<0.05),最高達(dá)到90.95%。濃度為5 mg/mL時(shí)清除率為62.76%,與曹榮等[27]的研究結(jié)果接近,但是低于同濃度的GSH(90.34%)。結(jié)果表明,變性處理組海參腸多肽確實(shí)具有一定的DPPH自由基清除能力。

圖5 變性處理組海參腸多肽的DPPH自由基清除率Fig.5 DPPH free radical scavenging rate of Stichopus japonicas guts peptides(denaturated)

3 結(jié)論

利用中性蛋白酶對(duì)海參腸進(jìn)行酶解,可獲得低分子量多肽,酶解效果比較好;海參腸經(jīng)變性預(yù)處理后,水解度和肽得率均有顯著提高(p<0.05),所得產(chǎn)物分子量集中于0.5～3 kDa,還原能力、ABTS+與DPPH自由基清除率檢測(cè)結(jié)果證明其具有一定的抗氧化能力。上述結(jié)果為今后對(duì)變性處理后的海參腸水解液中的活性多肽進(jìn)行分離、純化以及序列鑒定打下了基礎(chǔ)。