橄欖渣提取物對馬肉餅的抗氧化作用

楊志攀,孔令明,*,馮憲超,汪雪嬌,陳悅菲

(1.新疆農業大學食品科學與藥學學院,新疆烏魯木齊 830052;2.西北農林科技大學食品科學與工程學院,陜西楊凌 712100)

馬肉營養豐富,具有高蛋白、低膽固醇、高不飽和脂肪酸、營養素搭配合理的特點,而且味美可口,從而逐漸受到消費者青睞。尤其是日本、美國、西歐等一些國家大量進口馬肉以滿足日益增長的市場需求[1]。

然而,馬肉中不飽和脂肪酸含量高,在貯藏過程中容易發生氧化變質導致保質期縮短。氧化變質(脂質和蛋白質氧化)被認為是降低肉制品質量的主要因素之一[2]。這些變化在生肉制品中比在活體肉中更易發生,這是由于肉的自由基清除系統被削弱,并且與空氣的接觸面積增大[3]。脂質過度氧化還可能產生有毒有害物質,增加食用風險。脂質氧化反應產生的初級產物及次級產物化學性質不穩定,容易與肉中的其他成分(蛋白質、血紅素、抗氧化添加劑等)發生反應從而影響肉制品的品質[4]。肌肉蛋白的氧化會使肉品色澤變暗、持水性和嫩度下降,食用品質劣變,營養價值降低,消費者接受程度下降[5]。天然抗氧化提取物具有較高的安全性、無副作用和防腐保鮮等優點,得到了廣泛的關注。因此,許多學者致力于肉制品天然抗氧化劑的研發。例如,石榴皮提取物等對蛋白質和脂質氧化有抑制作用[6],迷迭香提取物對豬肉脂質氧化有抑制作用[7]。

橄欖渣是橄欖油工業副產物,其富含大量的有機物質,例如糖、單寧、多元醇、果膠、脂質和酚類[8]。橄欖渣中的酚類主要為脫咖啡酰基毛蕊糖苷(decaffeoylverbasco-side,3,DA)、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷(Luteolin-7-O-β-D-glucoside,LE)、6″-O-β-D-吡喃葡萄糖-橄欖苦苷(6″-O-β-D-glucopyranosyl oleuropein,GO)和橄欖苦苷(Oleuropein,OR)[9]。多酚可以通過清除自由基和螯合過渡金屬離子從而達到抑制氧化的目的。多酚的抗氧化活性是以其作為氫原子供體的能力為基礎,以中和自由基的活性[10]。一般而言,羥基酪醇和類烯丙醇衍生物的二羥基結構特征似乎是這些多酚的高抗氧化活性的主要原因,其次是4-O單羥基化合物(噻嗎啉和酪醇)和3-O羥基取代的兒茶酚[8]。因此,橄欖果渣成為天然抗氧化劑的廉價來源。

在中國,橄欖被大量種植在甘肅、廣東、廣西、云南、四川等地區[11],每年生產可觀的橄欖油,產生了大量的橄欖渣。目前,我國橄欖油企業產生的橄欖渣還沒有較好的利用方法,大量被丟棄。本研究采用橄欖渣提取物作為天然抗氧化劑,將其加入馬肉餅中,探究不同濃度得橄欖渣提取物對馬肉冷藏過程中色澤、脂質氧化、蛋白氧化的影響。從而為橄欖渣的廢物利用,改善馬肉餅貯藏過程的品質提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮橄欖渣 2016年12月由甘肅武都縣翔宇油橄欖有限公司提供;馬里脊肉 購于新疆烏魯木齊市朱蘭青肉制品批發市場;MDA試劑盒 南京建成生物科技有限公司;福林酚(FCR)、1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、α,α二甲基芐基過氧化氫、硫氰酸銨、2,2′-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、沒食子酸標準品、鹽(純度≥98%) Aladdin試劑公司;其他試劑 均為市售,國產分析純。

AL104型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;H2050R型臺式離心機 長沙高新技術產業開發區湘儀離心機儀器有限公司;UVmini-1240型紫外-可見分光光度計 日本京都島津制作所;KH5200B型超聲波清洗器 昆山禾創超聲儀器有限公司;IKA T18型高速勻漿機 上海楚柏實驗室設備有限公司;UltraScan PRO色差儀 美國Hunterlab公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 橄欖渣提取物的制備 準確稱取500.00 g橄欖渣,以料液比1∶1.5的比例加入80%的乙醇,750 W的功率條件下超聲波提取20 min,在12000 r/min的條件下進行離心15 min。此操作重復進行3次,合并上清液得到粗提液。將粗提液在38 ℃下旋蒸濃縮。濃縮物在-80 ℃條件下冷凍,在冷凍干燥器中冷凍干燥48 h,為橄欖渣提取物,備用。

1.2.2 總酚含量的測定 橄欖渣提取物中總酚含量的測定參照劉麗香等[12]的福林酚法,并稍作修改。多次預實驗后,將0.2 mL質量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的橄欖渣提取物與1.5 mL 0.2 mol/L Folin-酚試劑混合后避光反應5 min。然后加入1.5 mL 75 g/100 mL碳酸鈉溶液,避光反應1 h后,用分光光度計于725 nm波長處測吸光度。參考標準曲線y=0.0106x-0.0038R2=0.9959,總酚含量用沒食子酸(gallic acid,GA)當量(每克樣品干質量中酚類化合物相當于沒食子酸的毫克數,mg GAE/g DW)表示。

1.2.3 DPPH自由基清除能力測定 DPPH自由基清除能力測定參考Garzón等[13]方法,并稍作改動。取1 mL的20、40、60、80、100 μg/mL濃度橄欖渣提取物溶液分別與1 mL 0.1 mmol/L DPPH自由基醇溶液混合。避光反應30 min后,以蒸餾水作為參比于517 nm處分別測定吸光度。根據下列公式計算清除率:

式(1)

式中:A0為空白在517 nm處吸光度;A1為樣品在517 nm處吸光度。

1.2.4 ABTS+·清除能力測定 ABTS+·清除能力測定參考Mjtj等[14]的方法,稍作改動。ABTS溶液(7 mmol/L)與過硫酸鉀溶液(7.35 mmol/L)按2∶1(V/V)混合,室溫避光反應16 h得到ABTS+儲備液。將ABTS+儲備液用甲醇稀釋至在734 nm波長處吸光度達到0.70±0.02,即得ABTS+工作液。多次實驗后,將2、4、6、8、10 mg橄欖渣提取物與100 mL 80%的乙醇混合,各取25 μL 橄欖渣提取物溶液與2 mL ABTS+工作液混合,避光反應6 min后,于734 nm波長處測量各樣品的吸光度。用蒸餾水代替ABTS+工作液作為空白。

式(2)

式中:A樣品為樣品在734 nm處吸光度;A空白為空白在734 nm處吸光度。

1.2.5 馬肉餅的制作 基本配方:以馬肉后腿肉(1000.00±1.00) g計,加入(100.00±0.10) g水,(10.00±0.01) g鹽。空白組為基本配方,其樣品組分別添加0.2%、0.4%、0.6%的橄欖渣提取物,陽性對照組添加0.1%的BHT。剔除馬肉上可見筋膜,用刀間距為2 mm的切丁機進行切碎處理,此過程重復5次,以保證肉糜的均勻程度。準確稱量的基本配料和原料肉充分攪拌,用模具將攪拌均勻的肉糜定型成直徑為10 cm、厚度為1 cm的肉餅,參照Jia等[15]的肉餅包裝及貯藏方法,將肉餅放入聚丙烯盤中,用聚乙烯保鮮膜嚴密覆蓋,然后將包裝好的肉餅放入展示冷藏柜中4 ℃貯藏。由于每次測定時多個指標不能同時完成,所以分別在0、3、6、9 d取樣,并放置到-80 ℃冷凍柜中待測。

1.2.6 指標的測定

1.2.6.1 色差的測定 參照Moroney等[16]的方法,并略作修改。色差儀使用前先用標準板進行校正(Y=97.43,x=+0.39,y=+1.08),再采用D65光源,以未添加任何試劑的馬肉餅作為空白組,添加0.2%、0.4%和0.6%橄欖枝提取物的作為樣品組,添加0.1% BHT的作為陽性對照組。對肉餅表面的色澤(亮度L*、紅度a*、黃度b*)進行測定。

1.2.6.2 高鐵肌紅蛋白的含量的測定 參照Warris[17]的方法從生肉餅中提取肌紅蛋白,略作修改。將未添加任何試劑的馬肉餅作為空白組,添加0.2%、0.4%和0.6%橄欖枝提取物的作為樣品組,添加0.1% BHT的作為陽性對照組。分別與5倍質量的磷酸鹽緩沖液(40 mmol/L,pH=6.8)混合,然后在勻漿器中均質10 s。在4 ℃條件下放置1 h后,3500×g、4 ℃離心30 min。 通過濾紙過濾進一步澄清上清液。用分光光度計在525、572、700 nm下測量濾液的吸光度。 根據以下公式計算高鐵肌紅蛋白(Met Mb)含量。

式(3)

1.2.6.3 過氧化值的測定 參照Park等[18]的方法,略作修改。向1 g馬肉餅(以未添加任何試劑的作為空白組,添加0.2%、0.4%和0.6%橄欖枝提取物的作為樣品組,添加0.1% BHT的作為陽性對照組)中加入10 mL氯仿/甲醇(2∶1)提取脂質氫過氧化物。2000×g離心5 min后,取下層氯仿層2 mL與另外1.3 mL氯仿/甲醇(2∶1)混合,然后分別加入16.7 μL硫氰酸銨(3.94 mol/L)和氯化亞鐵(0.072 mol/L)。在室溫下溫育20 min后,在500 nm處測量吸光度,并且基于由氫過氧化枯烯制備的標準曲線計算過氧化值[19]。

1.2.6.4 丙二醛含量的測定 丙二醛含量的測定通過丙二醛檢測盒檢測,所有步驟完全按照操作說明進行。以未添加任何試劑的馬肉餅作為空白組,添加0.2%、0.4%和0.6%橄欖枝提取物的作為樣品組,添加0.1% BHT的作為陽性對照組。

1.2.6.5 羰基含量的測定 參照 Zhou等[20]的方法,略作修改。用0.6 mol/L的NaCl溶液將氧化后的肌原纖維蛋白配制成100 mg/mL蛋白溶液,取150 uL蛋白溶液,加入1 mL 20%的三氯乙酸(TCA),在4 ℃的條件下,以3040×g離心10 min,棄去上清液,加入1 mL的0.2%的DNPH(用2 mol/L的HCl 配制),避光振蕩1 h后,加入0.5 mL 20%的三氯乙酸(TCA),離心(4000×g,4 ℃,10 min),沉淀用 1.5 mL乙酸乙酯和乙醇(1/1,V/V)洗滌 3 次,并加入1.5 mL 6 mol/L的鹽酸胍溶液溶解沉淀(37 ℃,15 min),最后離心(500×g,4 ℃,5 min),測定上清液的 A370nm值。蛋白溶液含量用考馬斯亮藍法測定。

蛋白質羰基含量(nmol/mg)=(測定OD-對照管OD)/[22×比色光徑(cm)×樣品蛋白濃度(mg/L)]×125×105

式(4)

1.3 數據處理

實驗重復3次。所得數據用Excel 2003處理,SPSS 17.0進行方差分析,用Duncan’s Multiple Range Test進行多重比較分析,顯著水平為p<0.05。

2 結果與分析

2.1 橄欖渣提取物總酚含量的測定

橄欖渣提取物的總酚含量為(70.82±7.34) mg GAE/g DW。Bahar等[21]測定橄欖油中的總酚含量為64.19 mg GAE/g DW。說明橄欖渣中的總酚含量較高。植物多酚的多羥基結構賦予其一系列獨特的化學性質,而植物酚類與蛋白質的結合是其最重要的特征,蛋白質與多酚相互作用會引起蛋白質結構的改變,導致蛋白質的疏水-親水性的相應變化以及溶解度的改變。這些變化將會影響蛋白質的功能性質(例如乳化性、起泡性等)[22]。

2.2 橄欖渣提取物抗氧化活性

圖1所示,橄欖渣提取物的DPPH自由基清除能力都隨其濃度的升高而升高,但是當提取物濃度為80與100 μg/mL時,DPPH自由基清除率無顯著性差異(p>0.05)橄欖渣提取物的DPPH自由基清除率最大值達到80.07%,說明它們具有有效降低羥自由基、烷自由基或過氧自由基濃度、中斷脂質過氧化鏈反應的作用[23];橄欖渣提取物的ABTS+·清除能力隨其濃度的升高而升高,它是一種清除還原性離子的氧化自由基,其測定的清除率越高,表明橄欖渣提取物中還原性自由基含量越高但與DPPH自由基清除率相比較低,其原因是兩種電子的轉移速率不同。

圖1 橄欖渣提取物質量濃度對DPPH和ABTS+自由基清除能力分析Fig.1 Effect of olive extract concentration on DPPH and ABTS+ free radical scavenging capacity

2.3 橄欖渣提取物對馬肉餅色澤的影響

2.3.1 色差分析 由表1可知,前3 d無論是空白組還是不同橄欖渣提取物濃度的處理組,L*值均顯著升高(p<0.05),說明馬肉的顏色變化主要發生在前3 d。隨后3～9 d中0.2%的橄欖渣提取物使馬肉餅的L*值顯著降低(p<0.05),與BHT組一致,而0.4%和0.6%則使L*值小幅上升,這可能與馬肉餅中脂肪分布不均勻有關。a*為正值,代表肉餅的紅度。在貯藏過程中(3～9 d),與空白組相比,添加橄欖渣提取物使肉餅的a*升高。這可能是由于橄欖渣提取物可以阻止肌紅蛋白的氧化褐變。尤其是在6～9 d內,與空白組相比,在相同測試天數時,a*值隨橄欖渣提取物添加量的增加而升高,0.6%橄欖渣提取物能使馬肉餅的a*值顯著提高(p<0.05)。

表1 橄欖渣提取物不同添加量對馬肉餅貯藏過程中顏色(L*,a*,b*)的影響Table 1 Effects of different amount of Olive Pomace extract on color(L*,a*,b*)of horse patties during storage

隨著貯藏時間的增加,a*值逐漸降低,在0～3 d的過程中L*值與a*值呈相反變化,出現上升趨勢,在添加0.4%橄欖渣提取物時,L*值出現了一定的波動,這種波動可能是因為在制作馬肉餅時脂肪未能均勻分布所致。0.6%的橄欖渣提取物對a*值得影響略低于0.1% BHT,但是差值小于1。因此,消費者很難察覺含有0.6%的橄欖渣提取物的馬肉餅與含有0.1% BHT的馬肉餅之間的紅度差異。這說明0.6%橄欖渣提取物可以用來替代BHT的使用,具有穩定肉色的功效。

在0～9 d的貯藏過程中,空白組b*值有一定的升高。b*代表肉餅的黃度,與脂肪氧化有關。這說明橄欖渣提取物可能通過阻止肉餅中脂肪的氧化,從而穩定肉餅的黃度。

2.3.2 高鐵肌紅蛋白含量分析 由圖2可知,第0 d時,所有肉餅的高鐵肌紅蛋白(MetMb)含量均低于20%;除了對照組的之外,其他實驗組相互間差異不顯著(p>0.05)。隨著貯存天數的增加,所有樣品的MetMb含量均逐漸升高,這可能是由于馬肉中肌紅蛋白受到了氧化攻擊,從而導致馬肉的紅色逐漸變淡。這與色差測定結果是一致的(表1)。與空白組相比,隨著貯藏時間的增長,添加了橄欖渣提取物的樣品(0.2%、0.4%、0.6%)的MetMb含量顯著降低(p<0.05),且MetMb含量隨著橄欖渣提取物濃度的增加而顯著降低(p<0.05)。尤其在第6 d時0.6%橄欖渣提取物組的MetMb含量為33.7單位,與0.1% BHT組一致。以上結果說明橄欖渣提取物可以阻止馬肉餅中肌紅蛋白的氧化,且0.6%橄欖渣提取物抑制效果與0.1% BHT的抑制效果相近。

圖2 橄欖渣提取物不同添加量對馬肉餅貯藏過程中高鐵肌紅蛋白的影響Fig.2 Effect of the amount of olive pomace extract of metmyoglobin horse patties during storage注:字母不同,表示差異顯著(p<0.05)。

2.4 橄欖渣提取物對馬肉餅脂質氧化的影響

2.4.1 過氧化值 過氧化值是評估脂肪初始氧化程度的重要指標。抗氧化劑添加和貯存時間都對過氧化值有顯著的影響。由圖3可知,馬肉餅的過氧化值隨著橄欖渣提取物添加量的增高而降低,但是顯著高于0.1% BHT組(p<0.05)。在對照樣品中觀察到最高的初始過氧化值,在第3 d達到過氧化值的閾值,隨后快速下降。這種現象可被解釋為,空白樣品在冷藏貯存的前3 d內經歷明顯的脂質氧化,并在初次自動氧化結束時達到最大過氧化值,貯存3 d后,形成的氫過氧化物可能已分解形成次級氧化產物[24]。

圖3 橄欖渣提取物不同添加量對馬肉餅貯藏過程中過氧化值的影響Fig.3 Effect of the amount of olive pomace extract on different peroxide value of horse patties during storage

2.4.2 硫代巴比妥酸(TBARS)值 脂質氧化產物丙二醛可以與硫代巴比妥酸反應生成有色化合物,由此來衡量肉餅中的脂質氧化程度。由圖4可知,與對照組相比,添加橄欖渣提取物和BHT在整個貯藏過程中均能使馬肉餅的TBARS值顯著下降(p<0.05),說明橄欖渣提取物和BHT均能抑制脂質氧化,這歸因于其酚類物質可以通過阻斷自由基鏈式反應來抑制脂質氧化[25]。此外,馬肉餅的TBARS值隨橄欖渣提取物濃度的升高而逐漸降低,且0.6%橄欖渣提取物組的TBARS值與0.1% BHT組相當,說明0.6%的橄欖渣提取物與0.1% BHT發揮同樣的抗脂肪氧化效果。隨著貯存時間的增長,空白組、0.2%、0.4%組馬肉餅的氧化程度顯著加深,但0.6%橄欖渣提取物和0.1%BHT能顯著抑制脂質氧化,且使脂質氧化速率達到最低。這些結果表明,使用天然抗氧化劑可以有效地防止肉餅在冷藏過程中的脂質氧化。

圖4 橄欖渣提取物不同添加量對馬肉餅貯藏過程中硫代巴比妥酸值的影響Fig.4 Effect of different additives of olive slag extracts on the thiobarbituric acid value in the storage of horse patties

2.5 橄欖渣提取物對馬肉餅蛋白氧化的影響

蛋白質羰基含量用于衡量肉餅冷藏保存期間肌肉蛋白質的氧化程度。羰基含量增加表明肌肉蛋白受到氧化應激,導致一些氨基酸側鏈的氧化,如賴氨酸、脯氨酸、精氨酸和組氨酸殘基[26]。由圖5可知,隨著貯存時間的增長,蛋白質的氧化程度逐漸加深,但高濃度橄欖渣提取物對肉餅脂質氧化的抑制作用,顯著高于低濃度橄欖渣提取物的抑制作用(p<0.05)。值得注意的是,空白組和0.2%橄欖渣提取物組在6 d時由于蛋白質的羰基與游離胺基相互反應形成的席夫堿結構[27]。而其他各實驗組還未能形成席夫堿結構,所以在9 d時空白組與0.2%橄欖渣提取物組開始下降,0.4%、0.6%橄欖渣提取物組、0.1% BHT組繼續處于上升狀態。研究發現普通山楂,狗薔薇和榆樹葉黑莓提取物在冷藏貯存期間的12 d內能夠有效降低餡餅中的羰基形成;油菜籽和松樹皮提取物在熟豬肉餡餅中也觀察到類似的抑制作用[28]。

圖5 不同濃度橄欖渣提取物對馬肉餅貯藏過程中羰基含量的影響Fig.5 Effect of different concentrations of olive pomace extract on the carbonyl content of horse patties during storage

3 結論

本研究評估了橄欖渣提取物的總酚含量及其抗氧化能力,發現橄欖渣提取物總酚含量達到(70.82±7.34) mg GAE/g DW,并顯示出較強的清除DPPH和ABTS自由基的能力。將不同濃度橄欖渣提取物加至馬肉餅中,發現其對脂質和蛋白氧化具有明顯的抑制作用,并能夠穩定肉餅的色澤褪變。因此,使用橄欖油行業副產物—橄欖渣提取物作為天然抗氧化劑,可以作為天然抗氧化劑用來替代合成抗氧化劑,如BHT,應用到肉類產品中,既可滿足消費者對食品健康和安全品質的需求,也可為橄欖加工副產品的應用提供參考。