桑椹果酒主發酵過程中主要理化指標的變化

張 晶,左 勇,*,謝光杰,黃丹丹,孫時光,張 鑫,秦世蓉,何頌捷

(1.四川理工學院生物工程學院,四川自貢 643000;2.四川化工職業技術學院,四川瀘州 646000;3.川北醫學院基礎醫學院,四川南充 637000)

桑椹果酒是以新鮮桑椹為原料,接種酵母發酵而成的低度飲料酒,營養豐富,具有保健功效[1-2]。桑椹果酒主發酵過程中,隨著糖逐漸被消耗,醇類、酯類、酸類等各種物質大量生成,且各物質相互補充,賦予桑椹果酒獨特的風味特征,對果酒的口感和品質有著重要影響[3]。

針對桑椹果酒發酵過程中主要物質的變化情況,科研人員進行了相關研究,其中,王艷輝等[4]研究了不同溫度條件下桑椹果酒發酵過程中酒精的生成規律,確定了桑椹干紅最適發酵溫度。Wang等[5]考察了品種、溫度和環境對桑椹果酒中褪黑激素的影響。黃曉杰等[6]對桑椹果酒不同發酵階段抗氧化活性進行研究,發現縮短發酵時間有利于酚類物質的保留,會提高酒液的抗氧化能力。趙紅宇等[7]以桑椹干果為原料,考察了桑椹果酒全渣發酵過程中生物活性物質及其抗氧化活性的變化情況。可以看出,目前對桑椹果酒的研究主要是針對某種桑椹的某種特定成分,而對反應桑椹果酒發酵進程的主要理化指標的綜合性研究相對欠缺。在生產過程中,若不對桑椹果酒發酵過程進行實時監控,就不能對發酵條件進行針對性的控制,不利于果酒品質的保障。

因此,本實驗擬通過對桑椹果酒不同發酵階段主要理化指標的分析,初步揭示桑椹果酒主發酵過程中主要物質的變化規律,從而為桑椹果酒發酵過程的控制提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑椹 四川某農場;活性干酵母 安琪酵母股份有限公司;甲醇、有機酸(草酸、酒石酸、蘋果酸、α-酮戊二酸、乳酸、檸檬酸、丁二酸) 色譜純,天津市光復精細化工研究所;氫氧化鈉、重鉻酸鉀、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀、磷酸二氫鈉、無水乙醇、硫酸、磷酸等 均為分析純。

GZ-250-HS11型恒溫恒濕箱 韶關市廣智科技設備有限公司;YXQ-LS-75S11型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;LB20T型手持糖度計 成都格納絲商貿有限公司;BT125D型分析天平 上海精密科學儀器有限公司;HH-S型恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市正基儀器有限公司;T6型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;TW-2000W型可調溫電爐 成都市永興電器廠;STARTER 2C型pH計 奧豪斯儀器(上海)有限公司;78-1型磁力加熱攪拌器 常州一諾儀器制造有限公司;TGL-16G型臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;Agilent 1200型高效液相色譜 美國安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 桑椹果酒制備工藝及操作要點

1.2.1.1 工藝流程 桑椹果實→破碎打漿→成分調整(添加白砂糖、調酸)→主發酵→分離→后發酵→初濾→調整→陳釀→澄清→精濾→裝瓶→殺菌[8]。

1.2.1.2 操作要點 將桑椹置于室溫解凍,破碎打漿得桑椹汁,向桑椹果醪中添加一定量的白砂糖以調整果醪糖度為150 g/L,并按1 g/L的量加入檸檬酸以調節發酵醪酸度;按5%的比例接入酵母種子液(稱取2 g安琪活性干酵母于20倍質量的5%糖水中,于26～30 ℃活化60 min,將活化的酵母液接入發酵醪)于桑椹果醪中,將發酵醪置于26 ℃下發酵7 d,發酵過程中進行攪拌以便完全發酵;發酵結束時進行倒罐,并根據果醪糖度和酒精度,補加白砂糖,封罐進入后發酵,發酵8～10 d至殘糖含量小于4 g/L;經后發酵的桑椹果酒密封陳釀3～6個月;陳釀結束后,將桑椹果酒經板框過濾機過濾、裝瓶并進行巴氏滅菌。

1.2.1.3 取樣 將酵母接入發酵醪的時間計作發酵第0 d,桑椹果酒主發酵通常為7 d左右,從而設置樣品采集時間分別為0、1、2、3、4、5、6、7 d。

1.2.2 理化指標的測定 pH:采用pH計直接測定;總酸、揮發酸、總糖、干浸出物:參照GB-T15038-2006葡萄酒、果酒通用分析方法進行測定[9];酒精度:參照張建夫等[10]、魏曉霞[11]測酒精度的方法,并做相關修改,具體步驟為:先向比色管中加入5 mL 5%重鉻酸鉀溶液(5 g重鉻酸鉀和10 mL硫酸定容至100 mL),再分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 5%乙醇溶液,加蒸餾水定容至25 mL,置于85～90 ℃水浴鍋20 min,冷卻至常溫,測吸光值(600 nm),并繪制標準曲線。取50 mL桑椹發酵液,加入50 mL水進行蒸餾,至餾出液為50 mL左右,加水定容至100 mL,再取0.5 mL蒸餾液至裝有5 mL 5%重鉻酸鉀溶液的比色管中,并加蒸餾水定容至25 mL,測吸光值(600 nm),最后通過標準曲線計算酒精含量。

1.2.3 感官評定 感官評定小組由7名釀酒專業教師和學生組成,參照潘訓海等[12]桑椹果酒感官評定標準,對不同發酵階段桑椹果酒的色澤、香味、滋味、典型性4個方面進行感官評定,具體標準見表1。

表1 桑椹果酒感官評定標準Table 1 Sensory evaluation criteria for mulberry wine

1.2.4 有機酸的測定

1.2.4.1 色譜條件及標準曲線繪制 色譜柱:Gemini 5u C18110A(250 mm×4.6 mm,5micron);流速:0.7 mL/min;柱溫:35 ℃;進樣體積10 μL;檢測波長:210 nm;流動相:5%色譜甲醇-95%磷酸二氫鈉(0.02 mol/L)。分別配制有機酸單種標準溶液和混合標準溶液,并對混合標準溶液進行梯度稀釋,依次配制成0.5、0.25、0.125、0.0625倍的有機酸混合標準溶液。以有機酸標準品進樣濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,進行線性回歸,得到標準曲線[13]。根據保留時間對有機酸定性,以有機酸對應的峰面積作為縱坐標代入標準工作曲線定量分析樣品中有機酸濃度。

1.2.4.2 樣品的測定 取1.5 mL桑椹果汁和不同階段桑椹發酵液,10000 r/min離心10 min,以除去菌體和雜質,所得上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾得待測樣品[14],隨后進行液相色譜測定[15]。

1.3 數據處理

實驗數據經SPSS 19.0軟件分析,在0.05水平上對實驗結果進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 桑椹果酒發酵過程中pH與總酸的變化情況

pH和總酸對桑椹果酒的發酵有著重要影響,pH通過影響酵母菌體內酶系組成和活性以調節代謝產物[16];總酸不但影響微生物的代謝活動,而且還會對桑椹果酒的顏色、口感和風味造成影響[17]。其變化情況如圖1所示。

圖1 桑椹果酒主發酵過程中pH和總酸的變化Fig.1 Changes of the pH and total acid in mulberry wine during main fermentation process注:不同小寫字母表示總酸含量差異顯著(p<0.05);不同大寫字母表示pH差異顯著(p<0.05)。

由圖1可知,在桑椹果酒主發酵過程中,發酵醪pH總體上呈先下降后上升的趨勢,總酸反之。發酵0～1 d,pH快速下降,從4.32下降至4.06;與此相對應的是,總酸由3.31 g/L上升至6.64 g/L。導致總酸急劇上升的原因主要是酵母發酵產酸。發酵初期(第0～1 d),由于酵母迅速繁殖、代謝,發酵醪中的糖類物質被代謝成醇類、酸類等物質,使總酸升高,pH降低[18]。至發酵第2 d,桑椹果醪總酸迅速下降,此后總酸含量持續降低,到發酵第6～7 d,總酸變化趨于平緩(p>0.05),與此同時,桑椹醪液pH逐漸上升,直到發酵第7 d,pH不再顯著變化(p>0.05)。其原因可能是部分酸類物質在發酵過程中作為中間代謝產物轉化為其他物質,如酸和醇脫羧形成酯類物質,也可能是酸類物質的積累在一定程度上抑制了酵母產酸,造成總酸含量降低[19]。

2.2 桑椹果酒發酵過程中揮發酸的變化情況

揮發酸是酵母不完全發酵形成的副產物,適量的揮發酸賦予桑椹果酒愉悅的香氣,但揮發酸含量過高,將給人帶來尖酸感和不愉快的醋味,被認為是一種損害性物質,會影響桑椹果酒的口感和品質[20]。其變化情況如圖2所示。

圖2 桑椹果酒主發酵過程中揮發酸的變化Fig.2 Changes of volatile acidity in mulberry wine during main fermentation process注:不同大寫字母表示揮發酸含量差異顯著(p<0.05)。

由圖2可知,在桑椹果酒發酵過程中,揮發酸呈先上升后趨于平穩的趨勢。發酵0～1 d,桑椹果酒揮發酸含量快速上升,從0.11 g/L上升至0.45 g/L,發酵2～6 d,揮發酸含量仍呈逐漸上升的趨勢,但上升速度變緩,到發酵第7 d時,揮發酸含量趨于平穩(p>0.05)。在發酵初期(0～1 d),引起揮發酸升高的原因可能是隨著酵母的代謝,包括醋酸在內的各種酸類物質大量生成,而在桑椹果酒發酵中(2～6 d)、后期(7 d),揮發酸增長速度減慢,這主要是由于隨著發酵的進行,發酵醪中營養物質不斷被消耗,pH和總酸發生相應的變化,導致酵母活力降低,酵母正常代謝活動受到抑制,開始利用檸檬酸等作為底物代謝形成揮發酸等發酵副產物[21]。

2.3 桑椹果酒發酵過程中總糖與酒精度的變化情況

總糖和酒精度是考察桑椹果酒發酵是否正常進行的重要指標,在桑椹果酒主發酵過程中,總糖和酒精度含量的變化不僅反映糖的利用和酒精的產生情況,同時也反應發酵醪的發酵程度[22]。其變化情況如圖3所示。

圖3 桑椹果酒主發酵過程中總糖和酒精度的變化Fig.3 Changes of residual sugar and alcohol content in mulberry wine during main fermentation process注:不同小寫字母表示酒精含量差異顯著(p<0.05);不同大寫字母表示總糖差異顯著(p<0.05)。

由圖3可知,桑椹果酒發酵前2 d,發酵醪總糖含量急劇下降,從149.46 g/L下降至10.04 g/L,從發酵第2 d起,總糖含量仍緩慢降低并逐漸趨于平穩(p>0.05);與總糖相對應的是,桑椹果酒發酵前2 d,發酵醪酒精度急劇上升,從0%vol升高至7.45%vol,到發酵第3 d時,酒精度達到最高的7.63%vol,此后,發酵醪酒精度呈緩慢降低的趨勢,到發酵結束時為7.22%vol(p>0.05)。造成以上變化的原因主要是在桑椹果酒發酵初期(0～2 d)酵母代謝活動旺盛,糖類物質被大量用于酵母的生長繁殖和酒精發酵,從而導致發酵醪中總糖含量急劇降低,反之酒精含量迅速上升,隨著發酵進入中后期(2～7 d),酵母能利用的糖類物質減少,同時酒精的積累也會使酵母發酵性能受到一定程度的抑制,這些都是導致糖降解速率降低的原因[23],發酵過程中,由于部分醇類物質參與到酯類物質的合成,使酒精度呈現略微降低的趨勢。

2.4 桑椹果酒發酵過程中干浸出物的變化情況

干浸出物含量與桑椹原料及桑椹果酒生產工藝有著密切的關系,是評價桑椹果酒質量的一項重要指標。通過對桑椹果酒發酵過程中干浸出物含量的測定,可確定桑椹果酒是否摻假[24]。其變化情況如圖4所示。

圖4 桑椹果酒主發酵過程中干浸出物的變化Fig.4 Changes of dry extract in mulberry wine during main fermentation process注:不同大寫字母表示揮發酸含量差異顯著(p<0.05)。

由圖4可知,桑椹果酒發酵前2 d,干浸出物含量迅速上升,隨著發酵進入中后期(2～7 d),干浸出物增長趨勢減緩,直至發酵結束不再顯著變化(p>0.05)。造成干浸出物變化的原因主要是發酵前期桑椹發酵醪中營養豐富,酵母發酵性能良好,大量糖類物質被迅速代謝,使干浸出物含量快速上升,當發酵進入中后期,由于糖類物質減少,轉化為干浸出物的量也隨之減少[25]。

2.5 桑椹果酒發酵過程中有機酸的變化情況

有機酸是桑椹果實和果酒的重要組成部分,在果實的成熟階段、果酒的加工及陳釀階段都會引起有機酸組成和含量的變化。通過采用高效液相色譜法對桑椹果汁和不同階段桑椹發酵醪中草酸、酒石酸、蘋果酸、α-酮戊二酸、乳酸、檸檬酸、丁二酸等有機酸進行測定,得到各種有機酸含量見表2。

表2 桑椹果酒發酵主過程中有機酸的變化Table 2 Changes of organic acid in mulberry wine during main fermentation process

結果表明,桑椹果汁和發酵醪中有機酸的種類和含量存在明顯差異。桑椹果汁中蘋果酸、酒石酸、檸檬酸含量較高,草酸和丁二酸含量較低,不含有α-酮戊二酸和乳酸,這與文連奎等[26]的報道相吻合。與桑椹果汁相比,桑椹發酵醪中有機酸種類增多,新生成α-酮戊二酸和乳酸。在桑椹果酒主發酵過程中,除草酸含量降低以外,其它有機酸含量都有不同程度的增加,其中,蘋果酸含量呈緩慢上升的趨勢,其最終含量為0.812 g/L;酒石酸和檸檬酸的變化規律相似,都在第1 d時大量生成,此后隨著發酵的進行,酒石酸和檸檬酸含量先升高后降低,在發酵第3 d時其含量達到最高,分別為2.949、1.540 g/L;草酸和α-酮戊二酸含量始終維持在較低水平,其最終含量分別為0.122、0.107 g/L;乳酸、丁二酸隨著發酵時間的延長不斷積累,最終含量分別為2.303、1.079 g/L。

在桑椹果酒發酵初期(0～2 d),糖類物質作為主要的發酵基質被大量代謝成酸類、醇類及其它類物質,在此期間,有機酸大量生成,其中酒石酸、乳酸、檸檬酸、丁二酸含量急劇上升,草酸、α-酮戊二酸、蘋果酸含量小幅增加;在桑椹果酒發酵中期(3～5 d),由于發酵醪中總糖含量降低,酵母能利用的發酵基質減少,轉化為酸的量也隨之減少,從而導致發酵醪中有機酸增長速率減慢,部分有機酸(如酒石酸、蘋果酸、檸檬酸)含量達到最高;在桑椹果酒發酵后期(6～7 d),各種有機酸含量變化不一,造成這種變化的原因可能有:各種有機酸相互轉化,為細胞內物質的合成提供中間體;有機酸被徹底氧化,為細胞活動和物質的合成代謝提供能量。如,繼酒精發酵后的蘋果酸-乳酸發酵[27]使蘋果酸不斷向乳酸合成的方向轉化,導致乳酸含量不斷升高,而蘋果酸自身含量變化不大;酒石酸的降解也會增加乳酸的含量;發酵后期由于營養物質的缺乏,檸檬酸也會被當作底物被部分消耗,從而生成α-酮戊二酸、丁二酸等物質。

2.6 桑椹果酒發酵過程中感官變化情況

在桑椹果酒主發酵過程中,感官形態在一定程度上反應果酒的成熟程度和品質,其變化情況見表3。

表3 不同發酵階段桑椹果酒的感官記錄Table 3 Sensory analysis records of mulberry wine at different stages of fermentation process

醇類和酯類物質是構成桑椹果酒香氣的重要組成成分,其中醇類物質賦予桑椹果酒濃郁的酒香,酯類物質則構成果酒獨特的水果香氣和酯香[28]。隨著發酵的不斷進行,桑椹果醪中豐富的糖類物質在酵母的作用下被逐漸代謝形成醇類、酸類等物質,隨后醇類和酸類物質通過脫羧作用進一步生成酯類物質。由表3可知,發酵第3 d,桑椹果酒開始呈現出較濃的酒香味,但味道淡薄,缺乏典型性,這是由于酒精主要產生在桑椹果酒發酵前期,到發酵第3 d時其含量達到最高,所以有較濃的酒香味,但此時果酒中香氣物質單一,香味并不協調;而發酵后期果酒中醇類物質和酸類物質通過酯化反應生成酯類物質,賦予果酒酯香,進一步豐富了果酒香氣,使酒香馥郁,桑椹果酒發酵6 d后,酒體外觀顏色呈紫紅色,光澤感強,無懸浮物和沉淀,且果香濃郁,酒香馥郁,柔和爽口,具有桑椹果酒典型性,其感官形態基本達到最佳。

3 結論

桑椹果酒主發酵階段,pH先從4.32下降至4.06,后上升至4.22,總酸的變化與pH相反,其最終含量為4.31 g/L;揮發酸、干浸出物含量不斷升高,到發酵結束時其含量分別為0.72、20.15 g/L;總糖含量逐漸降低,從149.46 g/L下降到1.55 g/L,與此對應的是酒精度從0%vol由上升至7.22%vol;桑椹果酒中含量較高的有機酸為酒石酸、乳酸、檸檬酸,其最終含量分別為2.184、2.303、1.115 g/L;經感官評價,發酵6 d后的桑椹果酒感官形態基本達到最佳。

桑椹果酒主發酵前2 d是物質變化最活躍的階段,在此期間糖類物質被大量消耗,同時各種代謝產物迅速生成,而隨著發酵進入中期,各物質仍呈現出不同程度的變化,但變化趨勢較初期有所減緩,到果酒發酵第6 d時,各類物質含量達到穩定,說明主發酵過程已到達較好的效果,可以進入后發酵階段。