歐姆加熱殺菌對豆漿中微生物菌落總數的影響

單長松,吳 澎,+,封 鏵,宋華魯,李法德,*

(1.山東農業大學食品科學與工程學院,山東泰安 271018;2.山東農業大學機械與電子工程學院,山東泰安 271018)

歐姆加熱技術是一種新型的食品加工技術。其原理是利用電極將電流直接導入食品,利用食品物料自身的電導特性對食品進行加熱[1]。與傳統加熱方式相比,歐姆加熱過程中,物料升溫均勻、快速,能夠有效避免傳統加熱過程中所遇到局部過熱和焦糊現象等問題,保證食品的品質[2-4]。除此之外,歐姆加熱由于非熱效應—電場的作用,可以使食品中的微生物發生“電穿孔”效應,造成微生物細胞膜的破裂,內容物溶出,導致微生物的死亡[5]。因此,歐姆加熱可以有效降低食品的殺菌溫度。歐姆加熱技術還可以與無菌冷包裝相結合,具有廣闊的發展空間。

歐姆加熱技術應用于食品物料的殺菌最早可追溯至19世紀末,最初被應用于對液體原料的殺菌[6]。20世紀初,歐姆加熱技術逐漸在帶顆粒食品滅菌和乳制品加工方面取得應用性進展[7-8]。1937年,連續式歐姆加熱裝置開始應用于牛奶的巴氏殺菌[9]。該系統可以在15 s內將牛奶加熱至71 ℃,電能利用率高達95%～98%。但是,由于缺少合適的電極材料等問題,使得該技術未得到快速推廣。20世紀末,隨著新型電極材料的出現和電子技術的發展,歐姆加熱技術重新引起人們的重視,并被應用于液態雞蛋的殺菌[10]。英國APV Baker公司設計制造APV FX系列巴氏消毒系統,主要應用于對果汁和牛奶的加工,工作能力可達40000 L/h,能夠單獨作為殺菌系統與其他加工工藝組成熱裝罐生產線。歐姆加熱技術在國內的研究則相對較晚。歐姆加熱技術在殺滅牛奶中的微生物和蘋果汁中嗜酸耐熱菌方面取得的良好效果[5],使其備受青睞。但是,歐姆加熱殺菌技術在豆漿殺菌方面的研究較少。李修渠等[11]、劉志勝[12]、Li等[13]均對該技術在豆制品加工的應用做出了探索性研究,發現歐姆加熱可用于豆制品加工,并能夠鈍化豆漿中的部分抗營養因子。但是,有關該技術在豆漿殺菌方面的應用及其相關工藝參數還未見報道。

豆漿是傳統的植物蛋白飲品之一。由于其富含蛋白質、維生素以及大豆異黃酮等營養物質,深受人們的青睞[14]。但是,豆漿中豐富的營養物質也為微生物的繁殖提供了優良的培養基。豆漿的加工、生產和包裝過程中極易受到多種微生物的浸染,造成豆漿品質的下降和貨架期的縮短。常溫條件下(溫度高于25 ℃),鮮豆漿的保質期一般不超過24 h,冷藏條件(4 ℃)下,其保質期也不足3 d[15]。目前,工業生產中使用高溫瞬時(HTST)或超高溫(UHT)殺菌處理,可以大大延長豆漿的保質期[16-18]。但是,過高的殺菌溫度會對豆漿的營養物質造成不同程度的破壞。巴氏殺菌技術由于其殺菌時間長,也會對豆漿的營養物質造成破壞[19]。在豆漿中添加防腐劑,貨架期可以得到有效延長[20]。但多數消費者對防腐劑存在抗拒心理。因此,如何在豆漿的生產過程中實現安全、高效、低成本的殺菌以及與無菌冷包裝的結合,是亟待解決的一個重要問題。

本研究中采用歐姆加熱殺菌技術,以加熱溫度、電壓和電場頻率為參數,利用響應面法對豆漿中微生物的殺菌條件進行優化,為歐姆加熱技術在豆漿加工過程中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆(魯豆1號) 山東農業大學種子公司提供;胰蛋白胨 北京奧博星生物技術有限責任公司;酵母浸膏 天津市永大化學試劑有限公司;葡萄糖 上海國藥集團化學試劑有限公司;瓊脂 英國OXOID公司;氯化鈉 天津市永大化學試劑有限公司,以上試劑均為分析純(AR)。

MB-KS0601型磨漿機 江蘇松橋電器有限公司;ATY224型電子天平 日本島津公司;SW-CJ-1F型實驗型無菌操作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司;YXQ-LS-30SI型壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;YH-1A BOD型培養箱 姜堰市銀河儀器廠;550A型pH計 美國ORION公司;HP34970A型數據采集器 美國惠普公司;A2-20A-3V型霍爾電流傳感器 北京石新技術研究所;靜態歐姆加熱裝置 山東農業大學機械電子與工程學院。

1.2 實驗方法

1.2.1 豆漿樣品的制備 準確稱量50 g無破碎、無霉變的大豆種子,置于燒杯中,用去離子水反復洗滌3次后,按照豆水比1∶4的比例往燒杯中注入去離子水,室溫條件(25 ℃)下充分浸泡至大豆子葉中部發白、無凹坑(約14 h)。浸泡終止后,用去離子水沖洗3次后瀝干。按1∶8的豆水比(干質)加入去離子水后磨漿4 min,用100目濾布過濾后4 ℃保存備用。豆漿中可溶性固形物含量為8.47%±0.08%(GB 5009.3-2010 食品中水分的測定方法)。

1.2.2 歐姆加熱設備的操作 本研究中所使用的歐姆加熱裝置示意圖如圖1所示。加熱槽由聚丙烯板制成,板厚15 mm。加熱電極極板為304不銹鋼。數據采集系統由T型熱電偶、HP數據采集器和霍爾電流傳感器和T型熱電偶組成。歐姆加熱的電壓、頻率及溫度由數據采集器測量,測量時間間隔為10 s。電源的頻率范圍為50～10 kHz,電壓范圍0～250 V,波形為方波,占空比為50%。

圖1 歐姆加熱裝置Fig.1 Ohmic heating device注：1：加熱槽；2：極板(304不銹鋼)；3：豆漿樣品；4：熱電偶；5：電源；6：電流傳感器；7：數據采集器；8：電腦。

分別取制備好的生豆漿各200 mL,并測定各樣品組中生豆漿樣品的初始菌落總數,將豆漿樣品倒入加熱槽中,接通電源,對豆漿樣品進行歐姆加熱殺菌,測定殺菌后豆漿中的菌落總數。每組實驗結束后,用自來水徹底清洗加熱槽,然后用75%乙醇溶液噴霧消毒,最后再用無菌蒸餾水清洗備用。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 加熱溫度對豆漿中微生物菌落總數的影響 控制歐姆加熱電源頻率為500 Hz,電壓為180 V,分別將豆漿樣品加熱至60、70、80、90、100 ℃后不保溫,立即取樣。分別測定對照組和不同加熱溫度處理組中微生物的菌落總數,考察加熱溫度對豆漿中微生物菌落總數的影響。

1.2.3.2 保溫時間對豆漿中微生物菌落總數的影響 控制歐姆加熱電源頻率為500 Hz,電壓為180 V,將豆漿樣品加熱至70 ℃,分別保溫為0、10、20、30、40 s后取樣。分別測定對照組和不同保溫時間處理組中微生物的菌落總數,考察保溫時間對豆漿中微生物菌落總數的影響。

1.2.3.3 電壓對豆漿中微生物菌落總數的影響 控制歐姆加熱電源頻率為500 Hz,分別將電源電壓調整為140、160、180、200、220 V,將豆漿樣品加熱至70 ℃后立即取樣。分別測定對照組和不同電壓處理組中微生物的菌落總數,考察電壓對豆漿中微生物菌落總數的影響。

1.2.3.4 電場頻率對豆漿中微生物菌落總數的影響 控制歐姆加熱電源電壓為180 V,分別將電場頻率調整為100、300、500、700、900 Hz,將豆漿樣品加熱至70 ℃后立即取樣。分別測定對照組和不同電場頻率處理組中微生物的菌落總數,考察電場頻率對豆漿中微生物菌落總數的影響。

1.2.4 響應面實驗設計 在單因素實驗的基礎上,選取對影響豆漿中微生物殺滅率的3個主要因素,即加熱溫度、電壓和電場頻率,以豆漿加熱后微生物的殺滅率為檢測指標,采用Box-Behnken Design(BBD)實驗設計3因素3水平的響應面優化實驗(見表1),確定歐姆加熱對豆漿殺菌的最佳工藝參數。

表1 響應面分析因素與水平表Table 1 Factors and levels in response surface design

1.2.5 豆漿中微生物菌落總數的測定方法 豆漿中微生物菌落總數按GB 4789.2-2016規定的方法檢測[21]。

1.2.6 微生物殺滅率的計算 豆漿加熱殺菌后微生物的殺滅率按如下公式計算:

式(1)

式中:n表示微生物殺滅率(%);M表示豆漿中微生物菌落總數初始值(CFU/mL);M0表示豆漿加熱處理后微生物菌落總數(CFU/mL)。

1.3 數據處理

用Excel 2016和Origin 2017軟件對實驗數據進行統計分析和繪圖,用統計分析軟件SPSS 19.0對實驗數據進行相關性分析并進行顯著性檢驗;用Design Expert 8.0.6軟件,根據Box-Behnken組合原理進行實驗條件的優化。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 加熱溫度對豆漿殺菌效果的影響 由圖2可知,豆漿樣品經歐姆加熱處理過程中,微生物菌群殺滅率隨加熱溫度的升高而升高。當加熱溫度高于80 ℃后,微生物殺滅率的曲線逐漸趨于平穩。當加熱溫度在60～80 ℃時,豆漿中微生物菌群殺滅效率較高;當加熱溫度為80 ℃時,豆漿中微生物菌群殺滅率為98.4%±0.10%。當溫度高于80 ℃后,豆漿中微生物菌群基本被全部殺滅。由于研究過程中,需保留一定數量的微生物,以探究加熱溫度對微生物菌群的殺滅效果,因此,選取70 ℃為最適加熱溫度。

圖2 加熱溫度對微生物殺滅率的影響Fig.2 Effect of temperature on the bactericidal rate

2.1.2 保溫時間對豆漿殺菌效果的影響 由圖3可知,豆漿樣品經歐姆加熱處理后,保溫時間對豆漿中微生物菌群殺滅率的影響不顯著。保溫時間在0～40 s范圍內,微生物殺滅率雖然略有變化,但保溫前后微生物菌群殺滅率無顯著差異(p>0.05)。這可能是由歐姆加熱技術的特性造成的,歐姆加熱殺菌技術是依靠被加熱物料自身的導電特性來達到殺菌目的,且加熱快速、均勻,因此短時間的保溫對豆漿中微生物菌群的殺滅情況影響較小。綜上所述,歐姆加熱對豆漿樣品處理過程中,單純的熱效應對豆漿中微生物菌群的效果影響不大。

圖3 不同保溫時間對微生物殺滅率的影響Fig.3 Effect of holding time on the bactericidal rate

2.1.3 電壓對豆漿殺菌效果的影響 由圖4可知,豆漿樣品經歐姆加熱處理過程中,豆漿中微生物菌群殺滅率均隨電壓的升高而升高,當電壓高于180 V后,微生物殺滅率的曲線逐漸趨于平穩。歐姆加熱過程中,由于電壓的升高,兩極板間的電場強度逐漸增大,通過豆漿樣品的電流也逐漸增大,電流密度隨之增強,當達到一定值后會引起微生物菌體細胞膜表面的電穿孔[5],從而使豆漿樣品中微生物菌群的殺滅率升高;當其超過此臨界值后,微生物菌群已基本被殺滅。當電壓高于180 V后,電壓條件對豆漿中微生物菌群的殺滅率無顯著影響。因此,選取180 V為最適電壓。

圖4 電壓對微生物殺滅率的影響Fig.4 Effect of voltage on the bactericidal rate

2.1.4 電場頻率對豆漿殺菌效果的影響 豆漿樣品經歐姆加熱處理過程中,豆漿中微生物菌群殺滅率均隨電場頻率的升高呈先平穩后下降的趨勢。當電場頻率為100 Hz和300 Hz時,對豆漿中微生物菌群的殺滅效果較好,且兩者在殺菌效果上無顯著差異(p>0.05);當電場頻率高于300 Hz后,微生物殺滅率隨電場頻率的升高逐漸下降(圖5)。因此,選取300 Hz為最適電場頻率。

圖5 電場頻率對微生物殺滅率的影響Fig.5 Effect of frequency on the bactericidal rate

2.2 歐姆加熱殺菌參數的優化結果

2.2.1 響應模型的建立與顯著性檢驗 在單因素實驗的基礎上,以加熱時間、電壓、電源頻率為主要考察因素,以豆漿中微生物菌落總數的殺滅率為指標,采用Box-Behnken Design(BBD)實驗設計進行響應面分析。每個因素取3個水平,分別以1、0、-1編碼,利用Design-Expert 8.0.6進行數據分析,建立數學模型,優化歐姆加熱對豆漿中微生物菌群殺滅率的工藝參數(表2)。

表2 響應面分析實驗及結果Table 2 Experiments and the experimental results of response surface methodology

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中的實驗結果進行二次方程擬合,得到微生物殺滅率對加熱溫度、電壓和電場頻率的二次多項回歸方程的模型為:

R=98.00+6.81A+5.28B-0.74C-3.91AB+0.34AC+1.04BC-4.40A2-2.91B2-2.01C2

由表3中豆漿中微生物菌群殺滅率的回歸分析結果表明:此回歸模型的方差p<0.0001,說明二次多元回歸模型回歸效果極顯著;F失擬=3.040.05,不顯著;該模型的決定系數R2=0.9985,表明有99.85%的實驗數據的可變性可用此模型解釋,有總變異的0.15%不能用此模型解釋。因素A(加熱溫度)、B(電壓)、C(電場頻率)、A2、B2和C2對其曲面影響效應均極顯著(p<0.01)；AB和AC對豆漿中微生物菌群殺滅率的交互效應影響極顯著(p<0.01),而BC對其交互效應影響不顯著。也說明了各實驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系，綜上所述,此回歸模型的擬合度較好,預測值和真實值具有高度的相關性。

2.2.2 響應面圖分析 根據表3的回歸分析結果,得響應值和各實驗因子間的響應曲面圖,如圖6所示。圖6顯示了加熱溫度、電壓和電場頻率中任意兩個變量取零水平時,其余兩個變量對豆漿微生物菌群殺滅率的交互影響。等高線圖中同一橢圓區域內,微生物菌群的殺滅率是相同的,橢圓中心點為微生物殺滅率最高的點;由中心點向外緣延伸,殺滅率逐漸減少。等高線的形狀可以反映實驗因子交互作用的強弱,形狀越接近圓形則交互作用越不顯著。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model

由圖6可知,圖6(a)、6(c)中等高線的形狀較圖6(b)中的等高線的形狀更陡,因此加熱溫度與電壓、電壓與電場頻率的交互作用極顯著(p<0.01)大于加熱溫度與電場頻率的交互作用對豆漿微生物菌群殺滅率的影響。

圖6 任意兩變量對微生物殺滅率影響的響應曲面圖Fig.6 Response surface plots for the effects of any two variables on the bactericidal rate

2.3 驗證實驗

根據回歸模型分析結果,理論最佳提取工藝參數的優化結果如下:加熱溫度為81.69 ℃,電壓為199.63 V,電場頻率為190.12 Hz,在此最佳工藝條件下豆漿中微生物菌群的理論殺滅率為99.96%。為驗證該方法的可靠性,采用最優提取條件對豆漿中微生物菌群殺滅率進行3次平行驗證實驗,考慮實驗實施的可行性,將最佳殺菌工藝參數修正為:加熱溫度為82 ℃,電壓為200 V,電場頻率為190 Hz,實際實驗中豆漿中微生物菌群的殺滅率為100%,微生物的殘留量為(147±8) CFU/g,相對誤差為0.044%。實驗結果表明該回歸模型可以良好的預測豆漿中微生物菌群殺滅情況。

3 討論

目前,豆漿在工業化生產中仍使用鍋爐或蒸汽等傳統方法加熱,采用高溫瞬時(HTST)、超高溫(UHT)或者巴氏殺菌的方法殺菌,延長其貨架期。這種傳統工藝一方面對能源利用不充分,另一方面會在不同程度上影響豆漿的品質[19]。歐姆加熱技術在日本、英國等發達國家已相當成熟,并廣泛應用于食品加工業[10,22-24]。近幾年,國內對歐姆加熱技術的研究也逐漸增多,多集中于液體和半固體食品的加熱處理[25-28]。本研究對歐姆加熱技術在豆漿殺菌方面做出探索,發現歐姆加熱能有效殺滅豆漿中的微生物,且不同的電場條件對殺菌效果有一定的影響。在一定范圍內,殺菌效果與加熱溫度、電源電壓呈正相關的關系,這與高霞等[29]、羅玉福等[30]關于歐姆加熱在牛奶、番茄醬等殺菌方面的報道相一致。此外,賈琛等[31]在利用歐姆加熱對肉糜的加熱處理中,發現低頻電場更易于殺滅微生物,推測當電場頻率相對偏高時,帶點粒子可能未產生能夠沖擊菌體細胞膜的有效運動,致使殺菌效果偏差。本研究中也發現在一定電場頻率范圍內(100～900 Hz),相對低頻率的電場更有利于殺滅豆漿中微生物。但是,由于歐姆加熱電源自身屬性的限制,本研究中所使用的電源的最低電場頻率為100 Hz,殺菌效果良好,但對于電場頻率低于50 Hz條件下對豆漿的殺菌情況未能做出進一步探究。因此,進一步的研究工作可在研發頻率歐姆加熱電源和低頻條件對微生物的殺滅機理方面做出探究。

4 結論

采用歐姆加熱殺菌技術可有效殺滅豆漿中的微生物菌群,實驗因素影響殺菌效果的主次順序依次為:加熱溫度、電壓、電場頻率。在單因素實驗的基礎上,采用響應面法優化了殺滅豆漿中微生物菌群的電場參數,建立了加熱溫度、電壓、電場頻率3個因素對殺滅率的二次回歸方程模型。驗證實驗結果表明,該模型可準確分析預測各因素對歐姆加熱對微生物殺滅率的影響。通過響應面優化模型確定歐姆加熱殺菌的最佳條件為加熱溫度為82 ℃,電壓為200 V,電場頻率為190 Hz,此條件下歐姆加熱對豆漿中微生物菌群的殺滅率達100%,豆漿中微生物的殘留量為(147±8) CFU/g,遠小于1500 CFU/g,符合國標中的相關規定,因此,該模型可以為實際生產提供一定的理論依據。