結(jié)直腸癌組織中IGFBP-3、u-PA蛋白的表達變化及其意義

孫立園，趙楊，劉莎莎，薛晶，王瑞婷，申興斌

(1承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院，河北承德067000；2承德醫(yī)學院)

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，近年來我國結(jié)直腸癌發(fā)病率呈逐漸增高趨勢[1～4]。眾所周知，胰島素樣生長因子家族(IGFs)與多種惡性腫瘤的發(fā)生相關，其通過與相應受體結(jié)合發(fā)揮作用，可通過激活信號傳導通路及調(diào)節(jié)通路相關細胞因子水平，促進細胞的有絲分裂和分化。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3(IGFBP-3)是分泌蛋白家族中的一員，是IGFs的主要調(diào)節(jié)蛋白，在促進腫瘤形成的過程中發(fā)揮不可或缺的作用。IGFBP-3在組織中分布廣泛，通過調(diào)節(jié)IGFs的生物活性，促進或抑制細胞的增殖、分化及凋亡。尿激酶型纖溶酶原激活劑(u-PA)家族可降解細胞外基質(zhì)中的各種成分，從而使基質(zhì)、基底膜黏附性降低，有利于腫瘤細胞的浸潤、生長和轉(zhuǎn)移行為。目前關于IGFBP-3、u-PA與結(jié)直腸癌發(fā)生及進展的關系研究尚少。為此，本研究觀察了結(jié)直腸癌組織中IGFBP-3、u-PA的表達變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2016年1～12月在承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院接受手術治療的結(jié)直腸癌患者70例，男31例、女39例，年齡28～81歲，均為首發(fā)病例，患者在術前均未接受過放療、化療及免疫治療，排除糖尿病、慢性腎臟病史、糖皮質(zhì)激素用藥史；術中留取結(jié)直腸癌組織標本70例份。另取結(jié)直腸癌術后距癌組織約5 cm的正常結(jié)直腸黏膜組織標本20例份做對照，標本來源患者男12例、女8例，年齡35～72歲。兩組標本來源患者的基本資料具有可比性。

1.2 IGFBP-3、u-PA蛋白檢測 采用免疫組化Max Vision法，所取標本經(jīng)4%甲醛固定后，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，對組織蠟塊進行連續(xù)切片，切片厚度為4 μm。脫蠟至水，用3%的過氧化氫溶液在37 ℃中孵育30 min后，將0.01 mol/L枸櫞酸鈉溶液(pH 6.0)煮沸，將處理好的切片放入，熱修復12 min，室溫冷卻后清洗。滴加山羊血清封閉30 min后倒去，勿洗，滴加一抗工作液(IGFBP-3濃度為1∶100；u-PA濃度為1∶2500)，放入4 ℃冰箱過夜。第二天滴加二抗及辣根過氧化物酶后進行DAB顯色。最后經(jīng)蘇木素復染，透明、封片、鏡下觀察。兔抗人IGFBP-3抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。兔抗人u-PA抗體購自巴傲得生物科技有限公司。即用型羊抗兔Max Vision試劑盒、即用型DAB顯色試劑盒均購自北京中衫金橋生物技術有限公司。IGFBP-3、u-PA陽性產(chǎn)物均為棕黃色顆粒狀，位于細胞質(zhì)和細胞膜。每個切片于高倍鏡(400×)下選擇10個細胞染色集中且均勻的區(qū)域(熱點區(qū))，計數(shù)陽性細胞，以陽性細胞百分比≥25%判定為目的蛋白表達陽性。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman相關分析法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織及正常結(jié)直腸黏膜組織中IGFBP-3、u-PA蛋白表達比較 IGFBP-3陽性表達位于細胞膜和細胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒。結(jié)直腸癌組織、正常結(jié)直腸黏膜組織中IGFBP-3陽性表達率分別為21.43%(15/70)、80.00%(18/20)。u-PA陽性表達于細胞膜和細胞質(zhì)中，染色顆粒粗大，呈棕黃色。結(jié)直腸癌組織、正常結(jié)直腸黏膜組織中u-PA陽性表達率分別為65.71%(46/70)、15.00%(3/20)。結(jié)直腸癌組織中IGFBP-3陽性表達率低于NM組織，u-PA陽性表達率高于正常結(jié)直腸黏膜組織(P均<0.05)。

2.2 IGFBP-3、u-PA表達與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關系 IGFBP-3蛋白的表達與結(jié)直腸癌TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(P均<0.05)，u-PA蛋白的表達與結(jié)直腸癌TNM分期、浸泡深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(P均<0.05)，詳見表1。

表1 IGFBP-3、u-PA蛋白表達與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關系(例)

2.3 結(jié)直腸癌組織中IGFBP-3、u-PA蛋白表達的相關性 u-PA與IGFBP-3在結(jié)直腸癌組織中的表達呈負相關關系(r=-0.447，P<0.05)。

3 討論

目前對于惡性消化道腫瘤一般的治療手段是手術，雖然各種化療藥物及放療的應用已十分廣泛，但是由于惡性腫瘤有著十分復雜的分子機制，這導致患者的生存率并沒有提高，因此迫切需要學者尋找更多、更為合適的醫(yī)學治療手段。結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中涉及多種因子、多個步驟。癌變過程中，包括癌基因的激活、抑癌基因的失活、錯配修復基因的突變及基因過度表達等。雖然結(jié)直腸癌的治療手段逐漸豐富，但腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移仍嚴重影響著結(jié)直腸癌患者的治療效果。研究[5～8]表明IGFs及u-PA家族與眾多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移相關。因此，研究結(jié)直腸癌的分子機制及發(fā)展規(guī)律，對于早期診斷、治療乃至預后具有極其重要的意義。

有研究[9，10]發(fā)現(xiàn)，IGFs中與胰島素原高度同源的兩種多肽因子IGF-1和IGF-2除結(jié)構同源外其作用也類似，既可參與調(diào)節(jié)血糖的作用，還能調(diào)控多種細胞的增殖和分化。研究[8，9,11]顯示，IGFs通過與其受體結(jié)合，激活細胞信號傳導途徑發(fā)揮作用，主要涉及的兩個細胞信號傳導途徑包括絲裂原激活蛋白酶途徑(MAPK)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)途徑，兩條信號途徑既可促進細胞的有絲分裂，促進腫瘤細胞生長、增殖，亦能抑制腫瘤細胞的凋亡，被公認與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關。IGFBP-3是分泌蛋白家族中的一員，是IGFs的主要調(diào)節(jié)蛋白，在IGFs發(fā)揮促進腫瘤形成的過程中不可或缺。IGFBP-3在組織中分布廣泛，通過調(diào)節(jié)IGFs的生物活性，促進或抑制細胞的增殖、分化及凋亡。IGFBP-3在多種腫瘤的發(fā)生進展中起到抑癌基因的作用。研究[12，13]發(fā)現(xiàn)，IGFBP-3是IGFBP家族成員中與IGF-1結(jié)合能力最強的因子，可競爭性與IGF-1結(jié)合，抑制IGF-1促進細胞有絲分裂、加快細胞增殖分化及抑制凋亡的作用，因此這種抑制腫瘤生長作用是間接的；另外，IGFBP-3還可不依賴于IGF-1信號傳導途徑，而直接發(fā)揮抑制腫瘤的作用[14]。本研究結(jié)果顯示，IGFBP-3在結(jié)直腸癌組織中的陽性表達率低于正常結(jié)直腸黏膜組織，提示IGFBP-3表達下調(diào)與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展有關。推測在癌變過程中，涉及到的信號通路中某些細胞因子通過降低IGFBP-3的表達，加快了腫瘤進展。我們進一步分析發(fā)現(xiàn)，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期較高的結(jié)直腸癌組織中，IGFBP-3的表達下調(diào)，而在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期較低的結(jié)直腸癌組織中，IGFBP-3的表達上調(diào)，推測IGFBP-3參與了結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移過程，其低表達可加快腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

u-PA最早在卵巢腫瘤中發(fā)現(xiàn)，是一種高度特異性的絲氨酸蛋白酶，后經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，它可以由多種細胞如單核細胞、中性粒細胞、腫瘤細胞等合成[15]。u-PA發(fā)揮作用前是以無活性或活性很低的纖溶酶原(Pro-uPA)形式存在；Pro-uPA與受體結(jié)合后形成復合物，經(jīng)過復雜的轉(zhuǎn)化，u-PA變?yōu)橛谢钚缘牡鞍酌福瑥亩l(fā)揮降解或重塑細胞外基質(zhì)、介導細胞轉(zhuǎn)移的作用。u-PA還可通過參與多種途徑的信號轉(zhuǎn)導來增強腫瘤細胞的侵襲。Malinowsky等[16，17]發(fā)現(xiàn)，u-PA在甲狀腺癌、非小細胞肺癌及其他惡性腫瘤中的表達水平升高，可促進腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。郭穎等[18，19]發(fā)現(xiàn)，u-PA在肝癌、胃癌、卵巢癌等癌組織中的表達明顯高于正常組織。有研究[20]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移酶抑制劑法基尼通過誘導IGFBP-3的分泌降低了u-PA的分泌水平及活性；另外通過降低胰島素樣生長因子受體(IGF-R)及蛋白激酶B(Akt)的表達水平，有效抑制IGF-1信號通路的傳導，從而抑制頭頸部鱗癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。薛猛等[8]發(fā)現(xiàn)，HoxD10(同源盒基因)可直接結(jié)合到IGFBP-3的啟動子區(qū)域，在轉(zhuǎn)錄水平激活IGFBP-3在胃癌細胞中的表達；且干擾胃癌細胞中IGFBP-3的表達后，u-PA mRNA表達水平升高，推測u-PA參與了IGFBP-3調(diào)節(jié)胃癌細胞遷移、侵襲的過程。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中u-PA的陽性表達率高于正常結(jié)直腸黏膜組織；u-PA在侵及肌層、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高TNM分期的結(jié)直腸癌組織中的表達水平上調(diào)，推測其過表達加快了腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過程。相關性分析結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中IGFBP-3、u-PA表達呈負相關關系，推測二者共同參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生及進展。因二者涉及到的調(diào)控網(wǎng)絡中影響因子眾多且關系錯綜復雜，具體的調(diào)節(jié)因子及機制還有待進一步研究。