結直腸癌組織中CEACAM-1、NET-1的表達變化及其意義

郭飛，林楊，張鵬程，王玉佳，屈明，薛軍

(河北北方學院附屬第一醫院，河北張家口075000)

最新流行病學調查顯示，中國男、女結直腸癌發病率分別為16.9/10萬和11.6/10萬，死亡率分別為9.0/10萬和6.1/10萬，5年生存率僅為32%，遠低于美國和歐洲水平(64%和41%)，未來我國結直腸癌的負擔形勢不容樂觀[1,2]。目前，對于結直腸癌臨床常用的腫瘤標志物如CEA、CA199等對于病變的早期診斷均有一定的局限性，且特異性不高。因而深入探尋結直腸癌發生、發展的分子機制和特異性強、準確性高的分子生物學標志物，對于結直腸癌的早期診斷、術后監測及基因的靶向治療有著極其重要的價值。癌胚抗原相關細胞黏附分子-1(CEACAM-1)作為癌胚抗原家族重要成員之一，能調控細胞增殖、凋亡和分化，同時介導腫瘤細胞的黏附，還參與了血管淋巴管新生等病理生理過程，具有多種惡性生物學行為[3]。NET-1是新近研究的一種腫瘤致癌基因，與腫瘤細胞的增殖、遷移和浸潤密切相關[4]。研究證實，二者在乳腺癌、子宮頸癌、胰腺癌、胃癌、肝癌等惡性腫瘤中均呈高表達狀態[5～8]，而在結直腸癌中鮮有報道。本研究檢測結直腸癌組織及相應的癌旁正常結直腸組織中CEACAM-1和NET-1的表達及與相關臨床病理參數間的關系，為臨床早期診斷、治療和預后監測提供準確的分子生物學標志物，為結直腸腫瘤的三級預防提供科學依據和參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2015年1月～2016年12月在河北北方學院附屬第一醫院接受手術切除的原發性結直腸癌患者50例，手術中留取癌組織和癌旁正常結直腸組織。所有病例均為原發性腫瘤，其中男29例、女21例，年齡(54.7 ± 8.1)歲，結腸癌19例，直腸癌31例，TNM分期Ⅰ期4例、Ⅱ期7例、Ⅲ期27例、Ⅳ期12例，術前沒有進行針對性治療，術后標本均在1 h內獲得，并存于液氮中。

1.2 CEACAM-1、NET-1檢測方法 用10%甲醛溶液固定標本，然后用石蠟進行包埋、切片。應用蘇木素-伊紅經典染色，再行病理診斷。使用80℃烤箱對切片進行30分鐘的烤片，然后使用乙醇進行脫水，使內源性過氧化物酶失活，枸櫞酸緩沖液高壓高溫水化修復；PBS洗3次，加入一抗，溫度控制4℃過夜；PBS洗3次，加入二抗。接下來顯色過程應用DAB顯色試劑在室溫下進行，通過在鏡下看到的顯色情況掌握顯示的時間，而后用蘇木素進行輕度復染，并使用鹽酸乙醇(1%)進行5分鐘分化，流水持續5分鐘沖洗，另用80%、85%、90%、95%、100%的梯度乙醇脫水，最后用松節油5分鐘透明和樹膠封片處理。陰性對照為PBS代替一抗。 在細胞質中發現棕黃色顆粒作為CEACAM-1以及NET-1的陽性表達，依據視野所有細胞中發現的著色細胞所占百分比和著色細胞的染色程度強弱進行評分。其中著色細胞百分比≤5%計0分，6%～25%計分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，> 75%計4分；著色細胞無染色計0分，染色程度弱計1分，染色程度中計2分，染色程度強計3分。兩者相乘≥1視為陽性。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。計數資料以%表示，率的比較用χ2檢驗，相關分析采用Spearman相關分析法，設檢驗水準為α=0.05。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌、癌旁組織中CEACAM-1和NET-1表達情況 在結直腸癌組織中CEACAM-1的陽性表達率為68%(34/50)，癌旁組織中CEACAM-1的陽性表達率為28%(14/50)，兩者相比，P<0.05；在結直腸癌組織中NET-1表達的陽性表達率為64%(32/50)，癌旁組織中NET-1的陽性表達率24%(12/50),兩者相比，P<0.05。

2.2 CEACAM-1、NET-1表達與結直腸癌患者臨床病理參數間的關系 CEACAM-1和NET-1的陽性表達均與腫瘤的TNM分期、漿膜浸潤、淋巴結轉移、肝轉移及血管浸潤有關(P均<0.05)，而與腫瘤大小、分化程度無關(P均>0.05)，見表1。

2.3 結直腸癌組織中CEACAM-1和NET-1表達的相關性 在結直腸癌組織中CEACAM-1、NET-1的表達呈正相關(r=0.497，P<0.01)。

3 討論

近年來CEACAM-1在腫瘤發生進展中的作用備受關注，CEACAM-1是一種跨膜糖蛋白，屬于癌胚抗原家族及免疫超蛋白家族黏附分子之一，最初由Okegawa等[9]在研究木瓜蛋白酶質膜的不溶性成分的某些作用和功能時被發現。CEACAM-1基因定位于人類染色體的19q13.2區域，由9個外顯子按特定序列排列而成，在11種剪切方式下，可以生成11個不同的亞型，根據胞內段的長短可分為CEACAM-1-L和CEACAM-1-S兩個亞組[10]。CEACAM-1-L胞內段含有2個免疫受體酪氨酸抑制基因序列，通過其磷酸化參與細胞內信號轉導，其作用是對下游的信號進行抑制，CEACAM-1-S內含結合鈣調節蛋白、原肌球蛋白及肌動蛋白三種結構域，這使得它擁有了調節細胞骨架的特殊作用。CEACAM-1-L以一種順式的同源二聚體存在于細胞表面，有研究發現，在不同活化狀態下的該細胞二聚體是不相同的，這種不同可能是因為其參與的信號調節通路的不同所導致。另外，研究[11，12]發現還有一些CEACAM-1-L亞組可以形成特定的反式二聚體，聚集在細胞間，介導細胞間的黏附。此外，文獻[13]報道CEACAM-l蛋白參與了多種復雜的生物學過程，如調節細胞的增殖、凋亡以及細胞的分化，并對胰島素代謝、微血管微淋巴管的新生和免疫的調節等生理過程具有重要作用。

表1 結直腸癌組織中CEACAM-1、NET-1的表達與臨床病理參數的關系(例)

NET-1基因是與腫瘤相關的基因，是四聚體超家族的成員之一。NET-1基因定位于1p34.1，其mRNA全長為1297bp，編碼序列為128～853bp，內含241個氨基酸開放閱讀框，具有TM4SF的典型結構特征[14]。NET-1基因幾乎表達于所有的人類組織及相應腫瘤，通過跨膜結構區域的半胱氨酸殘基介導信號向胞外轉導，對于腫瘤預后不良的發生具有重要的調節作用，能夠參與到疾病發生發展的各個環節，在不同層面調節腫瘤的發生發展[15]。研究[16]證實，NET-1能通過激活ERK通路，誘導p27蛋白磷酸化、泛素化及降解，從而導致細胞周期調控紊亂；同時通過多種細胞外信號經ERK活化的方式逐級傳遞至細胞核，促進細胞無限增殖和遷移。

本研究顯示，在結直腸癌組織中CEACAM-1和NET-1的表達顯著高于癌旁組織，且二者均與腫瘤的TNM 分期、漿膜浸潤、淋巴結轉移、肝轉移以及血管浸潤有關。吳濤等[17]應用免疫組織化學方法檢測結直腸癌組織、腺瘤組織和正常結直腸組織中CEACAM1、VEGF的表達情況，并記錄MVD值，證實結直腸癌組織中CEACAM-1的異常表達能促進VEGF表達上調，參與腫瘤微血管的生成及血管浸潤轉移。申寶鳴等[18]報道大腸癌患者的血清中CEACAM-1水平明顯超過正常組，因此考慮CEACAM-1很可能是大腸癌早期診斷的一項重要指標。李挺等[19]研究報道NET-1在正常結腸黏膜、腺瘤和癌組織中陽性表達分別為7.4%、23.0%和90.0%，差異明顯，且與腫瘤分化、TNM分期和淋巴結轉移等病理特點密切相關，以上研究報道均與本研究結果一致。二者的相關性分析表明CEACAM-1和NET-1在結直腸癌的發生發展中呈正相關，表明二者具有協同作用，二者對腫瘤細胞的增殖、遷移和浸潤具有一致性，且二者均能誘導腫瘤微血管的形成和脈管的浸潤，因而對于結直腸癌的診療，倡導二者聯合檢測。

綜上所述，CEACAM-1和NET表達的異常增高參與了結直腸癌的發生、進展過程，與結直腸癌的病理特征密切相關，二者均可作為評估結直腸癌的潛在生物學指標，深入探究二者的作用機制，有望為結直腸癌精確治療提供重要的理論依據。