轉(zhuǎn)染miR-143的骨肉瘤細(xì)胞MG-63增殖能力、周期分布觀察

齊巍，李勇，琚紹靜，孫娜，張瑞杰

(1唐山市第二醫(yī)院，河北唐山063000；2華北理工大學(xué))

骨肉瘤惡性程度高，預(yù)后極差，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生早，所以探索新的治療方法迫在眉睫[1]。基因治療成為目前研究的熱點(diǎn)，其中尋求有效的治療靶點(diǎn)是基因治療的關(guān)鍵問(wèn)題之一[2]。微小RNA(miRNA)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，其通過(guò)與靶基因的mRNA3′-UTR完全或不完全互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，導(dǎo)致miRNA靶目標(biāo)降解或翻譯抑制從而調(diào)控基因表達(dá)，影響細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡等生物學(xué)行為[3]。miRNA-143是miRNA家族重要成員之一，是一種抑癌基因，在多種惡性腫瘤中呈低表達(dá)[4,5]。有研究[6]表明Bcl-2是miR-143的預(yù)測(cè)靶位點(diǎn)，miR-143通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡、抑制細(xì)胞增殖。本研究觀察了轉(zhuǎn)染miR-143的骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞周期變化，并探討其機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要實(shí)驗(yàn)材料 人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞系購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院天津血液研究所。MG-63細(xì)胞用含10% FBS、1% NEAA、1%雙抗的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，并置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，2～3 d后細(xì)胞鋪滿瓶底，細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至80%時(shí)可進(jìn)行傳代。FBS、RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；慢病毒載體購(gòu)于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，miR-143序列為5′-UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC-3′，陰性對(duì)照NC序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′；TRIzol試劑、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR PCR試劑盒均購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；MTT試劑盒購(gòu)于美國(guó)Biomol公司；miR-143抗體和Bcl-2抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam公司。

1.2 細(xì)胞分組及miR-143轉(zhuǎn)染 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG-63細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，分為實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白組。實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染miR-143序列，陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照NC序列，空白對(duì)照組加入PBS。轉(zhuǎn)染操作步驟參照慢病毒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，轉(zhuǎn)染48 h后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率，各組轉(zhuǎn)染率均為90%以上。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、空白組miR-143相對(duì)表達(dá)量分別為2.95±0.26、1.27±0.05、1.03±0.63，實(shí)驗(yàn)組miR-143相對(duì)表達(dá)量顯著高于陰性對(duì)照組和空白組(P均<0.05)，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染成功。

1.3 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 轉(zhuǎn)染24 h后收集各組細(xì)胞，以1.5×105/孔接種于96孔板中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。分別于12、24、48、72 h后加入15 μL的MTT(5 g/L)培養(yǎng)4 h，再加150 μL的DMSO，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)量570 nm波長(zhǎng)處的吸光度值(OD值)，以此表示細(xì)胞增殖能力。

1.4 細(xì)胞周期分析 轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)12～24 h，收集各組對(duì)數(shù)期細(xì)胞，離心管中加入預(yù)冷的70%乙醇2 mL懸浮細(xì)胞，置于4 ℃條件下固定細(xì)胞24 h；再次重懸細(xì)胞，離心5 min，去除上清液，加入PI染液600 μL；在室溫條件下避光40 min以上，再次過(guò)濾細(xì)胞懸液，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析不同周期細(xì)胞比例。

1.5 各組細(xì)胞中Bcl-2 mRNA及蛋白檢測(cè)

1.5.1 Bcl-2 mRNA檢測(cè) 采用RT-PCR法。收集各組對(duì)數(shù)期細(xì)胞，按TRIzol說(shuō)明書(shū)提取各組細(xì)胞總RNA，用分光光度計(jì)定量檢測(cè)。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA合成為cDNA后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。Bcl-2基因上游引物序列為5′-GCATGACTTCTCCCGCCTGTACCGT-3′，下游引物序列為5′-ACCTTAGCTGGCGCCGTACTGTTCT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為320 bp；內(nèi)參β-actin上游引物序列為5′-GATGCTGCGACTGGTCCA-3′，下游引物序列為5′- CTGCAGCAGCTATGAACCTC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為368 bp。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min、95 ℃變性30 s、57 ℃退火20 s、72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)后再72 ℃終末延伸5 min。對(duì)RT-PCR的結(jié)果采用相對(duì)定量的方法進(jìn)行分析。

1.5.2 Bcl-2蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。提取各組細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，與緩沖液按比例混勻，每泳道每組樣品取35 μg，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，配制5%的濃縮膠和10%的分離膠，進(jìn)行電轉(zhuǎn)，設(shè)置250 mA、90 min將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；滴加100 μL的一抗Bcl-2(1∶2 000)、一抗β-actin(1∶1 000)，4 ℃過(guò)夜；TBST洗10 min、共3次；加相應(yīng)二抗(1∶1 000)，37 ℃孵育1.5 h；TBST洗膜10 min、洗3次，進(jìn)行顯色，掃描儀掃描條帶，Image J軟件分析灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖能力比較 實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染后24、48、72 h細(xì)胞增殖能力低于空白組和陰性對(duì)照組(P均<0.05)。詳見(jiàn)表1。

2.2 各組細(xì)胞周期變化 實(shí)驗(yàn)組G0/G1期細(xì)胞比例高于空白組和陰性對(duì)照組，S期、G2/M期細(xì)胞比例低于空白組和陰性對(duì)照組(P均<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表1 各組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間的OD值比較

表2 各組不同周期細(xì)胞比例比較

2.3 各組細(xì)胞中Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)比較 實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白組Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.62±0.25、1.06±0.45、1.10±2.05；Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.083±0.039、0.215±0.035、0.233±0.016。實(shí)驗(yàn)組Bcl-2 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于空白組和陰性對(duì)照組(P均<0.05)。

3 討論

miRNA是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸。人類大約30%的基因表達(dá)受miRNA的調(diào)節(jié)。miRNA參與調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖和凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程[7]。miR-143是近年國(guó)內(nèi)外研究較多的一種miRNA，其在腫瘤發(fā)生中具有一定的調(diào)節(jié)作用。miR-143在多種腫瘤中呈低表達(dá)，如骨肉瘤[4]、乳腺癌[8]、結(jié)直腸癌[9]、前列腺癌[10]、膀胱癌[11]、宮頸癌[12]等；其通過(guò)與KRAS、c-Myc、ERK5和Bcl-2等多個(gè)靶基因作用，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增加抗腫瘤藥物的敏感性。

研究[13]表明miR-143在骨肉瘤中呈低表達(dá)，且miR-143可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和腫瘤形成，抑制細(xì)胞遷移和侵襲。我們前期研究表明，miR-143過(guò)表達(dá)可抑制成骨肉瘤143B細(xì)胞的侵襲及遷移能力[14]。本研究旨在觀察miR-143過(guò)表達(dá)對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響。我們首先通過(guò)慢病毒介導(dǎo)miR-143過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染骨肉瘤MG-63細(xì)胞，根據(jù)轉(zhuǎn)染熒光判斷轉(zhuǎn)染率達(dá)90%，依據(jù)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)組miR-143 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著增高，說(shuō)明慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染方法成功將miR-143轉(zhuǎn)染入MG-63細(xì)胞。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力逐漸降低，說(shuō)明miR-143過(guò)表達(dá)能夠抑制MG-63細(xì)胞的增殖；實(shí)驗(yàn)組處于G0/G1期的細(xì)胞比例顯著增高，而處于S期和G2/M期的細(xì)胞比例顯著降低，說(shuō)明miR-143過(guò)表達(dá)能夠延緩細(xì)胞周期進(jìn)展。

Osaki等[15]發(fā)現(xiàn)通過(guò)微靜脈注射miR-143可抑制裸鼠骨肉瘤細(xì)胞向肺部轉(zhuǎn)移。Bcl-2屬于抗調(diào)亡蛋白家族，Bcl-2的過(guò)表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Bcl-2的過(guò)表達(dá)可使腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性降低。Lee等[16]發(fā)現(xiàn)腎癌組織中Bcl-2的表達(dá)水平顯著增高。Uchida等[17]的研究結(jié)果顯示，使用Bcl-2反義核甘酸序列抑制Bcl-2表達(dá)后可抑制腎癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其調(diào)亡，推測(cè)Bcl-2的反義序列可以用于腎癌的治療。目前已發(fā)現(xiàn)多種miRNA可通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2的表達(dá)而起到抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)調(diào)亡的作用。Chen等[18]研究發(fā)現(xiàn)miR-181a可通過(guò)對(duì)Bcl-2的靶向調(diào)節(jié)作用而增加惡性膠質(zhì)瘤對(duì)放療的敏感性。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miR-143可抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而anti-miR-143促進(jìn)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡；高表達(dá)的miR-143可抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)，而anti-miR-143可上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)量，miR-143通過(guò)靶向調(diào)節(jié)Bcl-2表達(dá)從而抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡[6]。Zhang等[19]研究發(fā)現(xiàn)miR-143在骨肉瘤細(xì)胞中呈低表達(dá)，上調(diào)miR-143表達(dá)可以抑制細(xì)胞增殖活性及腫瘤形成能力并誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡，進(jìn)一步證實(shí)Bcl-2可能是miR-143作用的靶基因。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組Bcl-2 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于空白組和陰性對(duì)照組，提示miR-143可能通過(guò)作用于Bcl-2靶基因進(jìn)而抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞的增殖、干擾細(xì)胞周期。

隨著miRNA相關(guān)研究的不斷深入，miRNA有望成為骨肉瘤靶向治療的靶點(diǎn)。在骨肉瘤治療中通過(guò)外源性上調(diào)抑癌性miRNA水平將成為基本研究方向。由于miR-143可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，具備開(kāi)發(fā)成為抗腫瘤藥物的潛在價(jià)值。通過(guò)外源性介導(dǎo)補(bǔ)充、上調(diào)抑癌性miRNA的水平將成為miRNA用于腫瘤治療的基本方案。本研究結(jié)果也為我們進(jìn)一步研究miRNA對(duì)骨腫瘤的調(diào)節(jié)作用提供了一定的理論依據(jù)。但目前對(duì)骨肉瘤與miRNA之間的作用機(jī)制還沒(méi)有完全了解，對(duì)于外源性miRNA進(jìn)入體內(nèi)的途徑、時(shí)效性、生物安全性和治療效果等問(wèn)題仍需深入探索。