長鏈非編碼RNA BANCR在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)變化及對AGS細(xì)胞增殖、遷移能力的影響

馬松林，徐丹，王劍，孫圣斌，吳杰

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院，武漢430000)

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，患者5年總生存率不到30%[1～3]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度超過200個核苷酸的非編碼RNA[4]。研究[5]表明，lncRNA可在腫瘤的多種生物學(xué)過程如增殖、凋亡和免疫應(yīng)答等方面起關(guān)鍵作用。lncRNA BANCR與多種腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移相關(guān)，包括視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤[6]、肺癌[7]、黑色素瘤[8]等，但其在胃癌中的作用鮮有報道。本研究觀察了lncRNA BANCR在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)變化，及其對細(xì)胞增殖、遷移能力的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要實驗材料 胃癌細(xì)胞AGS、BSG823、MGC-803、Hs746T及正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1均購自美國ATCC細(xì)胞庫。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB1兩個亞基p50、p105及磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(p-ERK)一抗均購自Invitrogen公司，二抗購自美國BD公司。RPMI1640培養(yǎng)基、RT-PCR儀購自美國BD公司。HBS-1096B酶標(biāo)儀購自南京德鐵實驗設(shè)備有限公司。蛋白免疫印跡電泳設(shè)備購自美國Bio Rad公司。

1.2 胃癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA BANCR檢測 AGS、BSG823、MGC-803、Hs746T細(xì)胞及GES-1細(xì)胞均接種于RPMI1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后消化傳代。提取并分離細(xì)胞的RNA，采用NanoDrop1000分光光度計對RNA的濃度進(jìn)行測定，采用RT-PCR法檢測細(xì)胞中的lncRNA BANCR。lncRNA BANCR上游引物序列為5′-GAATTGCGTCATTTAAAGCCTAGTT-3′，下游引物序列為5′-GTTTCATCCTACCACTCCCAATTAAT-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物序列為5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物序列為3′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-5′。以2-ΔΔCt表示lncRNA BANCR的相對表達(dá)量。

1.3 lncRNA BANCR表達(dá)變化對AGS細(xì)胞增殖、遷移能力的影響觀察

1.3.1 AGS細(xì)胞分組及l(fā)ncRNA BANCR沉默方法 取AGS細(xì)胞分成LV-BANCR shRNA組、LV-NC組及BLANK組，用Lipofectamine2000分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-LV-BANCR shRNA(上游引物序列為5′-GGTCUTCTCUTTGCTCTUTCC-3′，下游引物序列為5′-GGUUUGUGCUUUGUGUUGUCC-3′)及pcDNA3.1-LV-NC shRNA(上游引物序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，下游引物序列為5′-UCGTGUCUCGTTCGGUGUUTT-3′)，BLANK組加入PBS。轉(zhuǎn)染濃度為300 nmol/孔。轉(zhuǎn)染48 h后，LV-BANCR shRNA組、LV-NC組、BLANK組lncRNA BANCR相對表達(dá)量分別為0.13±0.06、1.00±0.05、1.00±0.03，LV-BANCR shRNA組lncRNA BANCR相對表達(dá)量低于LV-NC組和BLANK組，提示轉(zhuǎn)染成功，可進(jìn)行下一步實驗。

1.3.2 細(xì)胞增殖能力檢測 MTT法測定三組細(xì)胞增殖能力。將LV-BANCR shRNA組、LV-NC組及BLANK組細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液后，以2×103/孔將細(xì)胞種植于96孔板上，每孔上樣200 μL，分別于培養(yǎng)0、1、2、3、4 d后加入20 μL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，在490 nm波長下用酶標(biāo)儀測定OD值表示細(xì)胞增殖能力。

1.3.3 細(xì)胞遷移能力檢測 采用細(xì)胞劃痕試驗。將LV-BANCR shRNA組、LV-NC組細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板，待細(xì)胞融合后，用滅菌槍頭用力劃直線。分別于劃痕后即刻和48 h在顯微鏡下觀察細(xì)胞劃痕修復(fù)情況，使用Wim Scratch在線圖像分析系統(tǒng)測定細(xì)胞劃痕面積，計算劃痕愈合率。劃痕愈合率=(劃痕后即刻的劃痕面積-劃痕后48 h的劃痕面積)/劃痕后即刻的劃痕面積×100%。實驗重復(fù)3次，取平均值。劃痕愈合率越高，表示細(xì)胞遷移能力越強(qiáng)。

1.3.4 細(xì)胞中NF-κB1 p50、NF-κB1 p105、p-ERK檢測 采用Western blotting法。將LV-BANCR shRNA組、LV-NC組細(xì)胞裂解、變性后，每孔上樣30 μg的蛋白；濃縮膠條件為50 min、80 V，分離膠條件為100 min、100 V，常規(guī)轉(zhuǎn)膜；加入NF-κB1 p50、NF-κB1 p105、p-ERK及GAPDH一抗，抗體濃度為1∶300，于4 ℃孵育過夜；二抗(1∶500)經(jīng)37 ℃孵育4 h后，PBST漂洗3次；在ECL液下顯影，Quantity One 1-D分析目標(biāo)蛋白灰度值。以目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值表示目的蛋白相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 AGS、BSG823、MGC-803、Hs746T細(xì)胞及GES-1細(xì)胞中l(wèi)ncRNA BANCR表達(dá)比較 AGS、BSG823、MGC-803、Hs746T細(xì)胞及GES-1細(xì)胞中l(wèi)ncRNA BANCR相對表達(dá)量分別為1.97±0.11、2.28±0.16、3.76±0.34、5.17±0.29和1.0±0.03，AGS、BSG823、MGC-803、Hs746T細(xì)胞中l(wèi)ncRNA BANCR相對表達(dá)量均高于GES-1細(xì)胞(P均<0.05)。

2.2 lncRNA BANCR表達(dá)變化對AGS細(xì)胞增殖能力的影響 培養(yǎng)3、4 d后，LV-BANCR shRNA組OD值小于LV-NC組和BLANK組(P均<0.05)。詳見表1。

表1 培養(yǎng)不同時間后各組AGS細(xì)胞OD值比較

2.3 lncRNA BANCR表達(dá)變化對AGS細(xì)胞遷移能力的影響 LV-BANCR shRNA組、LV-NC組劃痕愈合率分別為34.51%±2.29%、63.25%±4.73%，LV-BANCR shRNA組劃痕愈合率低于LV-NC組(P<0.05)。

2.4 lncRNA BANCR表達(dá)變化對AGS細(xì)胞中NF-κB1 p50、NF-κB1 p105、p-ERK表達(dá)的影響 LV-BANCR shRNA組NF-κB1 p50、NF-κB1 p105、p-ERK相對表達(dá)量分別為0.32±0.03、0.37±0.04、0.46±0.03，LV-NC組分別為1.0±0.04、1.0±0.03、1.0±0.06，LV-BANCR shRNA組NF-κB1 p50、NF-κB1 p105、p-ERK相對表達(dá)量均低于LV-NC組(P均<0.05)。

3 討論

胃癌是種常見的胃腸道惡性腫瘤，具有高致死率、高侵襲轉(zhuǎn)移能力等特點，常見的致病因素包括幽門螺桿菌感染、EB病毒感染等[9]。lncRNA的異常表達(dá)是腫瘤進(jìn)展的重要標(biāo)志。研究表明，lncRNA BANCR與多種腫瘤發(fā)展密切相關(guān)，其在肝癌[10]、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤[6]、骨肉瘤[10]中表達(dá)明顯上調(diào)，但是在肺癌[8]中表達(dá)顯著降低，提示lncRNA BANCR在不同的腫瘤類型中可能起到抑癌或促癌兩種截然不同的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，AGS、BSG823、MGC-803、Hs746T細(xì)胞中l(wèi)ncRNA BANCR相對表達(dá)量高于GES-1細(xì)胞，培養(yǎng)3、4 d后LV-BANCR shRNA組OD值小于LV-NC組和BLANK組，LV-BANCR shRNA組劃痕愈合率低于LV-NC組，表明lncRNA BANCR在胃癌細(xì)胞中高表達(dá)，沉默lncRNA BANCR表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移能力，提示lncRNA BANCR是胃癌的促癌基因。

NF-κB是與腫瘤密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，在細(xì)胞增殖、凋亡、分化、侵襲及腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移中起重要作用。NF-κB由兩個亞基形成同源或異源二聚體，并與連接蛋白形成復(fù)合體，綁定到應(yīng)答基因的啟動子，由此調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄活性[11]。研究[12]發(fā)現(xiàn)，NF-κB1可通過調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶、細(xì)胞黏附分子、環(huán)氧合酶2和血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲等過程。細(xì)胞周期蛋白D1可受NF-κB1的誘導(dǎo)而參與腫瘤細(xì)胞增殖等致癌過程。Liu等[12]發(fā)現(xiàn)，miRNA-9通過下調(diào)NF-κB1表達(dá)，進(jìn)而抑制黑色素瘤和卵巢癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。文獻(xiàn)[13]報道B淋巴細(xì)胞可通過調(diào)控NF-κB亞基Rel和NF-κB1，影響處于靜息狀態(tài)和有絲分裂狀態(tài)下的細(xì)胞周期進(jìn)程，影響凋亡過程。本研究中，LV-BANCR shRNA組NF-κB1 p50、NF-κB1 p105相對表達(dá)量均低于LV-NC組，表明lncRNA BANCR沉默后胃癌細(xì)胞中的NF-κB1表達(dá)受抑制，推測NF-κB1表達(dá)降低削弱了胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲能力。

研究[14]發(fā)現(xiàn)，MAPK信號通路是進(jìn)化上高度保守的信號途徑，可將細(xì)胞外信號傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)及核內(nèi)，從而引起細(xì)胞內(nèi)響應(yīng)。ERK是典型的MAPK信號通路分子，當(dāng)接受上游的級聯(lián)反應(yīng)信號后，ERK蛋白受磷酸化而激活，激活后的MAPK/ERK在細(xì)胞增殖、分化、血管生成、腫瘤侵襲等生物過程中具有重要作用[15]。在多種惡性腫瘤中(如胃癌、膠質(zhì)瘤)存在MAPK/ERK信號通路異常激活。目前已有大量研究指出腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移與MAPK/ERK途徑有緊密關(guān)聯(lián)。Han等[16]發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MALAT1抑癌功能的發(fā)揮是由于MAPK/ERK失活及基質(zhì)金屬蛋白酶-2表達(dá)下調(diào)。還有研究[7,8]指出lncRNA BANCR通過激活MAPK/ERK促進(jìn)黑色素瘤和肺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，LV-BANCR shRNA組p-ERK相對表達(dá)量均低于LV-NC組，推測lncRNA BANCR沉默后細(xì)胞中MAPK/ERK信號通路受抑制，因而減弱了胃癌細(xì)胞的增殖、遷移能力。

綜上，lncRNA BANCR在胃癌細(xì)胞中高表達(dá)。沉默lncRNA BANCR表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移能力，其機(jī)制可能與NF-κB1 p50、NF-κB1 p105及p-ERK表達(dá)下調(diào)有關(guān)。盡管具體分子機(jī)制仍有待于進(jìn)一步探索，但上述研究結(jié)果對于揭示胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制、開發(fā)腫瘤靶向治療的靶點具有一定意義。