氧化苦參堿對miR-122低表達、感染HBV肝細胞的抗病毒作用觀察

張軒，王淏

(1廣東省中醫院/廣州中醫藥大學第二附屬醫院，廣州510120；2廣州市血液中心)

乙型肝炎病毒(HBV)能夠侵襲肝臟，并引起急性和慢性乙型肝炎。乙型肝炎的防治是一個全球性公共衛生問題，已引起世界各國的關注[1]。目前，乙型肝炎多采用核苷(酸)類似物和干擾素等抗病毒藥物進行治療，但干擾素不良反應較多，而核苷(酸)類似物長期使用容易使病毒產生耐藥[2]?？鄥A類生物堿是從山豆根、苦參、苦豆子類中草藥中提取分離出來的單體化合物，主要包括氧化苦參堿(OMT)、苦參堿等。現代藥理學研究發現，以OMT為代表的苦參堿類生物堿具有保肝降酶、免疫調節、抗HBV及抗纖維化的作用[3]。OMT的抗病毒作用機制不同于核苷類藥物，對臨床上出現的拉米夫定耐藥HBV具有顯著的抑制作用[4]。但OMT的抗HBV作用機制尚未完全明確。有研究[5]表明，OMT可能通過提高細胞中微小RNA-122(miR-122)的表達水平來抑制病毒復制和抗原表達。因此，本研究觀察了OMT對miR-122低表達、感染HBV肝細胞的抗HBV作用，從miR-122的角度進一步研究OMT的抗HBV作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要實驗材料 HepG2.2.15細胞購自ATCC，培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基(含100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素)中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，用Trypsin-EDTA消化液消化傳代。DMEM培養基、磷酸鹽緩沖液PBS、胰酶Trypsin-EDTA、青霉素(100 U/mL)、鏈霉素(100 μg/mL)、胎牛血清均購于GIBCO公司。OMT(純度>98%)購于陜西昂盛生物科技有限公司。CCK-8試劑盒購于天根生物科技有限公司。miRNA熒光定量PCR試劑盒、miR-122抑制劑 hsa-miR-122-5p inhibitor、miR-122抑制劑陰性對照 inhibitor Negative Control #22購自廣州市銳博生物科技有限公司。RNA酶抑制劑購自美國Thermo Scientific公司。熒光定量PCR試劑盒購自美國Bio-Rad公司。轉染試劑Lipofectamine2000購自Invitrogen公司。

1.2 細胞分組與miR-122表達抑制方法 取1瓶處于對數生長期的HepG2.2.15細胞，制備2×104/mL的細胞懸液，按1 mL/孔接種于兩個12孔細胞培養板。將細胞分為A、B、C、D、E、F組共6個組，每組設置3個復孔。細胞接種24 h后將A、B、C組更換為無血清DMEM培養基，D、E、F組更換為配制好的含4 mg/mL OMT的無血清DMEM培養基。同時A、D組加入轉染試劑；B、E組加入轉染試劑和miR-122抑制劑hsa-miR-122-5p inhibitor；C、F組加入轉染試劑和miR-122抑制劑陰性對照inhibitor Negative Control #22。48 h后收集各組細胞，采用熒光定量PCR法檢測miR-122。miR-122表達抑制率=(對照孔-實驗孔)/對照孔×100%。

1.3 各組培養液上清中HBsAg、HBeAg及細胞中HBV DNA檢測 于轉染后48 h收集各組培養液上清和細胞，采用電化學發光法檢測培養液上清中的HBsAg和HBeAg，采用熒光定量PCR法檢測細胞中的HBV DNA。

2 結果

2.1 各組miR-122表達比較 A、B、C、D、E、F組miR-122相對表達量分別為1.00±0.26、0.72±0.15、1.04±0.28、3.09±0.94、1.27±0.59、3.00±0.62。B組miR-122相對表達量小于A、C組(P均<0.05)，miR-122表達抑制率約30%。E組miR-122相對表達量小于D、F組(P均<0.05)，miR-122表達抑制率約58%。

2.2 各組培養液上清中HBsAg、HBeAg水平及細胞中HBV DNA表達比較 E組培養液上清中HBsAg、HBeAg水平及細胞中HBV DNA表達低于B組，高于D組和F組(P均<0.05)。D組培養液上清中HBsAg、HBeAg水平及細胞中HBV DNA表達低于A組(P均<0.05)，F組培養液上清中HBsAg、HBeAg水平及細胞中HBV DNA表達低于C組(P均<0.05)。詳見表1。

表1 各組HBsAg、HBeAg、HBV DNA水平比較

3 討論

miRNA在細胞增殖、凋亡、分化及個體發育等一系列生理過程中發揮著重要作用。miR-122作為肝臟特異性高表達的miRNA之一，在肝臟的分化發育和維持肝臟正常功能中發揮重要的作用，與肝臟的生物學功能及肝臟疾病發病密切相關[6]。miR-122能夠促進丙型肝炎病毒(HCV)感染和肝內復制[7]；抑制miR-122能夠減緩脂肪酸合成并能促進其氧化[8]；miR-122在肝癌組織中明顯下調[9]。在HBV感染方面，miR-122能夠抑制HBV的復制，可以作為新的乙型肝炎治療靶點[10]。本課題組研究[5]發現，OMT能明顯提高肝細胞中miR-122表達，同時對HBsAg、HBeAg和HBV DNA均具有明顯的抑制作用。因此，我們推測OMT有可能通過提高miR-122的表達對HBV的復制產生抑制作用。本文在此基礎上，進一步對miR-122在OMT抗病毒中的作用進行研究。我們先敲低miR-122的表達，結果顯示B組miR-122相對表達量小于A、C組，E組miR-122相對表達量小于D、F組，表明HepG2.2.15細胞中miR-122表達敲低成功。進一步檢測培養液上清中的HBsAg、HBeAg及細胞中的HBV DNA發現，D組低于A組(P均<0.05)，F組低于C組(P均<0.05)，提示OMT可抑制HBV的復制。E組培養液上清中HBsAg、HBeAg水平及細胞中HBV DNA表達高于D組和F組，表明miR-122敲低后，OMT對HBV復制的抑制作用減弱，推測OMT對HBV復制的抑制作用可能是通過調節miR-122表達實現的。

本文研究還發現，E組培養液上清中HBsAg、HBeAg水平及細胞中HBV DNA表達低于B組，說明即使miR-122表達抑制，OMT仍然可以降低HBsAg、HBeAg和HBV DNA的水平。推測其原因：①miR-122抑制劑并沒有完全阻遏miR-122的表達，本研究中B組和E組miR-122的抑制率分別為30%和58%，OMT還可通過部分miR-122發揮作用；②OMT能夠通過miR-122對HBV的復制起到抑制作用，但并不是惟一途徑。OMT還有可能通過其他機制對病毒產生抑制作用。最近有研究[11]表明，OMT能夠降低HBV感染小鼠模型的HBV DNA、HBsAg、HBeAg和HBcAg的水平，這種作用有可能與OMT促進CD4+T細胞產生干擾素γ有關。本研究中，OMT處理細胞72 h后，細胞形態趨于向正常肝細胞變化[5]，推測其可能通過某些機制改善肝細胞微環境，調節免疫細胞活性，從而達到抗病毒的作用，但具體機制有待進一步研究。

此外，本研究結果還顯示，轉染miR-122抑制劑48 h后，B組與A組HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平差異無統計學意義。也就是說，即使B組中miR-122的抑制率達到30%，也沒有對病毒的復制產生影響，原因可能為HepG2.2.15細胞本身miR-122表達量較低，再對其進行抑制也不能使其表達量發生很大變化，因此不會對病毒的復制產生較大影響。

綜上所述，OMT對miR-122表達下調HepG2.2.15細胞的抗HBV作用受到抑制，OMT可能通過調節miR-122的表達對HBV復制起抑制作用，但這可能只是OMT作用機制的一部分，OMT還可能通過其他途徑對HBV復制產生影響。本研究結果為進一步研究OMT的抗HBV治療機制提供了實驗基礎和理論依據。