氧化苦參堿對(duì)miR-122低表達(dá)、感染HBV肝細(xì)胞的抗病毒作用觀察

張軒，王淏

(1廣東省中醫(yī)院/廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣州510120；2廣州市血液中心)

乙型肝炎病毒(HBV)能夠侵襲肝臟，并引起急性和慢性乙型肝炎。乙型肝炎的防治是一個(gè)全球性公共衛(wèi)生問題，已引起世界各國的關(guān)注[1]。目前，乙型肝炎多采用核苷(酸)類似物和干擾素等抗病毒藥物進(jìn)行治療，但干擾素不良反應(yīng)較多，而核苷(酸)類似物長期使用容易使病毒產(chǎn)生耐藥[2]。苦參堿類生物堿是從山豆根、苦參、苦豆子類中草藥中提取分離出來的單體化合物，主要包括氧化苦參堿(OMT)、苦參堿等。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，以O(shè)MT為代表的苦參堿類生物堿具有保肝降酶、免疫調(diào)節(jié)、抗HBV及抗纖維化的作用[3]。OMT的抗病毒作用機(jī)制不同于核苷類藥物，對(duì)臨床上出現(xiàn)的拉米夫定耐藥HBV具有顯著的抑制作用[4]。但OMT的抗HBV作用機(jī)制尚未完全明確。有研究[5]表明，OMT可能通過提高細(xì)胞中微小RNA-122(miR-122)的表達(dá)水平來抑制病毒復(fù)制和抗原表達(dá)。因此，本研究觀察了OMT對(duì)miR-122低表達(dá)、感染HBV肝細(xì)胞的抗HBV作用，從miR-122的角度進(jìn)一步研究OMT的抗HBV作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要實(shí)驗(yàn)材料 HepG2.2.15細(xì)胞購自ATCC，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素)中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用Trypsin-EDTA消化液消化傳代。DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液PBS、胰酶Trypsin-EDTA、青霉素(100 U/mL)、鏈霉素(100 μg/mL)、胎牛血清均購于GIBCO公司。OMT(純度>98%)購于陜西昂盛生物科技有限公司。CCK-8試劑盒購于天根生物科技有限公司。miRNA熒光定量PCR試劑盒、miR-122抑制劑 hsa-miR-122-5p inhibitor、miR-122抑制劑陰性對(duì)照 inhibitor Negative Control #22購自廣州市銳博生物科技有限公司。RNA酶抑制劑購自美國Thermo Scientific公司。熒光定量PCR試劑盒購自美國Bio-Rad公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購自Invitrogen公司。

1.2 細(xì)胞分組與miR-122表達(dá)抑制方法 取1瓶處于對(duì)數(shù)生長期的HepG2.2.15細(xì)胞，制備2×104/mL的細(xì)胞懸液，按1 mL/孔接種于兩個(gè)12孔細(xì)胞培養(yǎng)板。將細(xì)胞分為A、B、C、D、E、F組共6個(gè)組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞接種24 h后將A、B、C組更換為無血清DMEM培養(yǎng)基，D、E、F組更換為配制好的含4 mg/mL OMT的無血清DMEM培養(yǎng)基。同時(shí)A、D組加入轉(zhuǎn)染試劑；B、E組加入轉(zhuǎn)染試劑和miR-122抑制劑hsa-miR-122-5p inhibitor；C、F組加入轉(zhuǎn)染試劑和miR-122抑制劑陰性對(duì)照inhibitor Negative Control #22。48 h后收集各組細(xì)胞，采用熒光定量PCR法檢測miR-122。miR-122表達(dá)抑制率=(對(duì)照孔-實(shí)驗(yàn)孔)/對(duì)照孔×100%。

1.3 各組培養(yǎng)液上清中HBsAg、HBeAg及細(xì)胞中HBV DNA檢測 于轉(zhuǎn)染后48 h收集各組培養(yǎng)液上清和細(xì)胞，采用電化學(xué)發(fā)光法檢測培養(yǎng)液上清中的HBsAg和HBeAg，采用熒光定量PCR法檢測細(xì)胞中的HBV DNA。

2 結(jié)果

2.1 各組miR-122表達(dá)比較 A、B、C、D、E、F組miR-122相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.26、0.72±0.15、1.04±0.28、3.09±0.94、1.27±0.59、3.00±0.62。B組miR-122相對(duì)表達(dá)量小于A、C組(P均<0.05)，miR-122表達(dá)抑制率約30%。E組miR-122相對(duì)表達(dá)量小于D、F組(P均<0.05)，miR-122表達(dá)抑制率約58%。

2.2 各組培養(yǎng)液上清中HBsAg、HBeAg水平及細(xì)胞中HBV DNA表達(dá)比較 E組培養(yǎng)液上清中HBsAg、HBeAg水平及細(xì)胞中HBV DNA表達(dá)低于B組，高于D組和F組(P均<0.05)。D組培養(yǎng)液上清中HBsAg、HBeAg水平及細(xì)胞中HBV DNA表達(dá)低于A組(P均<0.05)，F(xiàn)組培養(yǎng)液上清中HBsAg、HBeAg水平及細(xì)胞中HBV DNA表達(dá)低于C組(P均<0.05)。詳見表1。

表1 各組HBsAg、HBeAg、HBV DNA水平比較

3 討論

miRNA在細(xì)胞增殖、凋亡、分化及個(gè)體發(fā)育等一系列生理過程中發(fā)揮著重要作用。miR-122作為肝臟特異性高表達(dá)的miRNA之一，在肝臟的分化發(fā)育和維持肝臟正常功能中發(fā)揮重要的作用，與肝臟的生物學(xué)功能及肝臟疾病發(fā)病密切相關(guān)[6]。miR-122能夠促進(jìn)丙型肝炎病毒(HCV)感染和肝內(nèi)復(fù)制[7]；抑制miR-122能夠減緩脂肪酸合成并能促進(jìn)其氧化[8]；miR-122在肝癌組織中明顯下調(diào)[9]。在HBV感染方面，miR-122能夠抑制HBV的復(fù)制，可以作為新的乙型肝炎治療靶點(diǎn)[10]。本課題組研究[5]發(fā)現(xiàn)，OMT能明顯提高肝細(xì)胞中miR-122表達(dá)，同時(shí)對(duì)HBsAg、HBeAg和HBV DNA均具有明顯的抑制作用。因此，我們推測OMT有可能通過提高miR-122的表達(dá)對(duì)HBV的復(fù)制產(chǎn)生抑制作用。本文在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)miR-122在OMT抗病毒中的作用進(jìn)行研究。我們先敲低miR-122的表達(dá)，結(jié)果顯示B組miR-122相對(duì)表達(dá)量小于A、C組，E組miR-122相對(duì)表達(dá)量小于D、F組，表明HepG2.2.15細(xì)胞中miR-122表達(dá)敲低成功。進(jìn)一步檢測培養(yǎng)液上清中的HBsAg、HBeAg及細(xì)胞中的HBV DNA發(fā)現(xiàn)，D組低于A組(P均<0.05)，F(xiàn)組低于C組(P均<0.05)，提示OMT可抑制HBV的復(fù)制。E組培養(yǎng)液上清中HBsAg、HBeAg水平及細(xì)胞中HBV DNA表達(dá)高于D組和F組，表明miR-122敲低后，OMT對(duì)HBV復(fù)制的抑制作用減弱，推測OMT對(duì)HBV復(fù)制的抑制作用可能是通過調(diào)節(jié)miR-122表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

本文研究還發(fā)現(xiàn)，E組培養(yǎng)液上清中HBsAg、HBeAg水平及細(xì)胞中HBV DNA表達(dá)低于B組，說明即使miR-122表達(dá)抑制，OMT仍然可以降低HBsAg、HBeAg和HBV DNA的水平。推測其原因：①miR-122抑制劑并沒有完全阻遏miR-122的表達(dá)，本研究中B組和E組miR-122的抑制率分別為30%和58%，OMT還可通過部分miR-122發(fā)揮作用；②OMT能夠通過miR-122對(duì)HBV的復(fù)制起到抑制作用，但并不是惟一途徑。OMT還有可能通過其他機(jī)制對(duì)病毒產(chǎn)生抑制作用。最近有研究[11]表明，OMT能夠降低HBV感染小鼠模型的HBV DNA、HBsAg、HBeAg和HBcAg的水平，這種作用有可能與OMT促進(jìn)CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生干擾素γ有關(guān)。本研究中，OMT處理細(xì)胞72 h后，細(xì)胞形態(tài)趨于向正常肝細(xì)胞變化[5]，推測其可能通過某些機(jī)制改善肝細(xì)胞微環(huán)境，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性，從而達(dá)到抗病毒的作用，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

此外，本研究結(jié)果還顯示，轉(zhuǎn)染miR-122抑制劑48 h后，B組與A組HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。也就是說，即使B組中miR-122的抑制率達(dá)到30%，也沒有對(duì)病毒的復(fù)制產(chǎn)生影響，原因可能為HepG2.2.15細(xì)胞本身miR-122表達(dá)量較低，再對(duì)其進(jìn)行抑制也不能使其表達(dá)量發(fā)生很大變化，因此不會(huì)對(duì)病毒的復(fù)制產(chǎn)生較大影響。

綜上所述，OMT對(duì)miR-122表達(dá)下調(diào)HepG2.2.15細(xì)胞的抗HBV作用受到抑制，OMT可能通過調(diào)節(jié)miR-122的表達(dá)對(duì)HBV復(fù)制起抑制作用，但這可能只是OMT作用機(jī)制的一部分，OMT還可能通過其他途徑對(duì)HBV復(fù)制產(chǎn)生影響。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究OMT的抗HBV治療機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。