miR-495在骨肉瘤細胞中表達變化、對MG-63細胞增殖的影響及其機制

王美鳳，邢國英，宮錦蕾，孫英華，夏海，王復超，張兆卿

(1濰坊醫學院附屬益都中心醫院，山東濰坊262500；2大連醫科大學附屬第一醫院)

骨肉瘤是兒童和青少年最常見的原發性骨惡性腫瘤，其來源于間葉組織，多發生于長骨干骺端，易早期發生轉移，惡性程度極高，預后較差，其發病機制目前仍不清楚。近年來，骨肉瘤患者的生存率得到一定提高，但化療的耐藥性及毒性反應較大，因此，探索骨肉瘤的發生發展機制，尋找有效的基因治療靶點意義重大[1]。微小RNA(miRNA)是高度保守的內源性非編碼小RNA，能夠在轉錄后水平調控靶基因表達，參與腫瘤的發生、發展過程[2,3]。研究發現miR-495與惡性腫瘤的關系密切，在胃癌[4]、食管癌[5]、前列腺癌、非小細胞肺癌[6]、膀胱癌[7]等多種實體腫瘤中發揮著抑癌基因的作用。目前有關miR-495在骨肉瘤中表達情況的研究甚少，并且作用機制尚不明確。高遷移率族蛋白A2(HMGA2)是高遷移率族蛋白超家族重要成員之一，近年來被公認作為一種新的癌基因參與惡性腫瘤的發生發展[8]。本研究觀察了miR-495在骨肉瘤細胞中的表達變化，及其對骨肉瘤MG-63細胞增殖的影響，并探討可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要實驗材料 人骨肉瘤細胞系Saos-2、U20S、MG-63及人成骨細胞系hFOB1.19均購自美國菌種保藏中心。Saos-2、U20S、MG-63細胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養液培養。hFOB1.19細胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養液培養。所有細胞均在37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養，定期換液，細胞融合至75%～80%時常規傳代。miR-495 mimics、陰性對照mimics-NC、HMGA2表達質粒、miR-495及內參U6引物均由上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成。TRIzol總RNA提取試劑盒及Lipofectamine2000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司。逆轉錄試劑盒及real-time PCR試劑盒購自大連寶生物公司。real-time PCR儀購自瑞士Roche公司。雙熒光素酶報告檢測試劑盒購自美國Promega公司。CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。HMGA2單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗均購自美國Santa Cruz公司。

1.2 不同骨肉瘤細胞系中miR-495檢測 采用real-time PCR法。按照試劑盒說明書用TRIzol提取細胞總RNA，分光光度儀檢測RNA的純度及濃度，按逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄得到cDNA。miR-495上游引物序列為5′-TCCGATTCTTCACGTGGTAC-3′，下游引物序列為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；內參U6上游引物序列為5′-TCCGATCGTGAAGCGTTC-3′，下游引物序列為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。以cDNA為模板，參照real-time PCR試劑盒說明書配置PCR反應體系。反應條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。miR-495相對表達量以2-ΔΔCt表示。

1.3 miR-495對MG-63細胞增殖的影響觀察

1.3.1 細胞分組及miR-495 mimics轉染 采用脂質體介導法，轉染前1 d將處于對數生長期的MG-63細胞消化、離心，以2×105/孔接種于6孔細胞培養板，待細胞融合度為50%～70%時進行轉染。將MG-63細胞分為陰性對照組、miR-495 mimics組、miR-495 mimics+HMGA2組，分別轉染mimics-NC、miR-495 mimics、miR-495 mimics+HMGA2表達質粒。

1.3.2 細胞中miR-495檢測 采用real-time PCR法，具體操作參考“1.2”。轉染后24h，miR-495 mimics組、miR-495 mimics+HMGA2組和陰性對照組細胞中miR-495的相對表達量分別為43.63±3.84、41.08±4.20、1.01±0.07。miR-495 mimics組和miR-495 mimics+HMGA2組細胞中miR-495相對表達量高于陰性對照組﹙P均<0.01﹚，證明轉染miR-495 mimics能夠明顯提高MG-63細胞中miR-495的表達。

1.3.3 細胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。取轉染后的各組細胞，加入胰酶消化后重懸細胞制備單細胞懸液，調整細胞密度為1×105/L。分別取200 μL的各組細胞懸液接種于96孔板，各組設5個復孔，于24、48、72、96 h后參照CCK-8試劑盒操作說明書向每孔加入10 μL的CCK-8溶液，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中避光孵育2 h，采用酶標儀測定450 nm波長處的OD值，表示細胞增殖能力。

1.4 miR-495靶基因預測及對HMGA2的靶向調控作用觀察

1.4.1 miR-495靶基因預測 應用靶基因在線預測數據庫miRanda(www.microrna.org)并結合基因的功能分析進行miR-495的靶基因預測。

1.4.2 miR-495與靶基因的結合位點分析 采用雙熒光素酶報告實驗驗證miR-495與靶基因的結合位點。將HMGA2的3′UTR的PCR擴增產物連接到pGL3質粒XbalⅠ酶切位點，構建野生型pGL3-HMGA2-wtUTR報告基因質粒。對miR-495與HMGA2的3′UTR結合處的堿基進行定點突變，突變后得到的新的質粒為突變型pGL3-HMGA2-mutUTR報告基因質粒。取MG-63細胞制備單細胞懸液，接種于96孔板，用Lipofectamine2000試劑進行轉染，轉染后分為HMGA2野生型質粒對照組(轉染野生型pGL3-HMGA2-wtUTR報告基因質粒和mimics-NC)、HMGA2野生型質粒實驗組(轉染野生型pGL3-HMGA2-wtUTR報告基因質粒和miR-495 mimics)、HMGA2突變型質粒對照組(轉染突變型pGL3-HMGA2-mutUTR報告基因質粒和mimics-NC)、HMGA2突變型質粒實驗組(轉染突變型pGL3-HMGA2-mutUTR報告基因質粒和miR-495 mimics)。四組轉染24 h后裂解細胞，按照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書操作，計算相對熒光酶活性。相對熒光酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。

1.4.3 細胞中HMGA2蛋白檢測 采用Western blotting法。細胞分組與轉染方法參照“1.3.1”，收集轉染后的細胞，PBS洗滌細胞3遍，加入RIPA細胞裂解液冰上裂解30 min，離心收集上清液，BCA法測定蛋白濃度。每上樣孔加入20 μg蛋白，進行10% SDS-PAGE電泳，將電泳分離后的蛋白質電轉移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，加入適當濃度的HMGA2一抗和β-actin一抗，4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3次后，再加入適當濃度的二抗室溫孵育2 h，洗膜，加入ECL顯影液顯影、定影。蛋白的相對表達量以目的蛋白條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值表示。

2 結果

2.1 不同骨肉瘤細胞系中miR-495表達比較 Saos-2、MG-63、U20S細胞及hFOB1.19細胞中miR-495的相對表達量分別為0.43±0.06、0.22±0.08、0.36±0.06、1.01±0.02。Saos-2、MG-63、U20S細胞中miR-495的相對表達量低于hFOB1.19細胞(P均<0.01)。

2.2 miR-495對MG-63細胞增殖的影響 轉染后48、72、96 h后miR-495 mimics組MG-63細胞OD值低于陰性對照組，miR-495 mimics+HMGA2組MG-63細胞OD值高于miR-495 mimics組(P均<0.01)。詳見表1。

表1 各組細胞不同時間OD值比較

2.3 miR-495的靶基因及結合位點 HMGA2的3′UTR區存在與miR-495的種子序列理論上互補的結合位點，HMGA2可能是miR-495的直接調控靶基因。雙熒光素酶報告實驗結果顯示，HMGA2野生型質粒實驗組、HMGA2野生型質粒對照組、HMGA2突變型質粒實驗組和HMGA2突變型質粒對照組細胞熒光素酶活性分別為0.31±0.09、1.01±0.03、0.98±0.04、1.02±0.04，HMGA2野生型質粒實驗組細胞熒光素酶活性低于HMGA2野生型質粒對照組(P<0.01)，而HMGA2突變型質粒實驗組與HMGA2突變型質粒對照組的細胞熒光素酶活性差異無統計學意義(P>0.05)。這證實miR-495能夠特異性結合HMGA2的3′UTR區，使熒光蛋白表達水平明顯降低，而HMGA2的3′UTR區突變后則無此作用，提示miR-495可與HMGA2的3′UTR區特異性結合。

2.4 miR-495表達變化對MG-63細胞中HMGA2蛋白表達的影響 miR-495 mimics組、miR-495 mimics+HMGA2組和陰性對照組細胞中HMGA2蛋白相對表達量分別為0.23±0.10、0.94±0.06、1.01±0.04。miR-495 mimics組MG-63細胞中HMGA2蛋白的相對表達量低于陰性對照組，miR-495 mimics+HMGA2組MG-63細胞中HMGA2蛋白的相對表達量高于miR-495 mimics組(P均<0.01)。

3 討論

近年來隨著表觀遺傳學的發展，miRNA在疾病中作用越來越受到重視。研究顯示，在多數惡性腫瘤中存在miRNA的異常表達，miRNA在惡性腫瘤的發生發展過程中發揮著重要作用[9]。miR-495基因定位于染色體14q32.31，屬于近期發現的miRNA重要家族成員之一，其在機體細胞增殖、凋亡及機體免疫、炎癥反應方面起著重要的作用。研究發現miR-495表達異常與腫瘤細胞的增殖、凋亡及腫瘤細胞化療耐藥關系密切。miR-495在大部分實體腫瘤中發揮著抑癌基因的作用，但在肝細胞癌、乳腺癌等少數實體腫瘤中表達升高，起著癌基因的作用[10]。本研究中檢測了骨肉瘤細胞Saos-2、U20S、MG-63及人成骨細胞hFOB1.19中的miR-495，發現miR-495在骨肉瘤細胞中表達均明顯下調，提示miR-495在骨肉瘤中可能起著抑癌基因的作用。為了研究miR-495對骨肉瘤細胞增殖的影響，我們通過脂質體介導法將miR-495 mimics成功轉染入骨肉瘤MG-63細胞，CCK-8實驗顯示上調miR-495能夠明顯抑制MG-63細胞的增殖，證實了上述推論。

目前miR-495對惡性腫瘤調控的具體分子機制尚不明確。為了研究miR-495調控骨肉瘤細胞增殖的機制，我們應用靶基因預測數據庫miRanda，并結合基因的功能分析，預測到HMGA2為miR-495的可能靶基因，并通過雙熒光素酶報告實驗證實miR-495能夠特異性的結合HMGA2的3′UTR區，使熒光蛋白活性明顯降低。Western blotting檢測HMGA2蛋白，結果顯示上調miR-495表達后骨肉瘤細胞中HMGA2蛋白表達量明顯降低，充分證實了miR-495對HMGA2存在靶向負調控作用，HMGA2是miR-495直接調控的靶基因之一。

HMGA2是一種非組蛋白染色體蛋白，是高遷移率族蛋白超家族成員之一。HMGA2基因被認為是一種新的癌基因，在甲狀腺癌[11]、卵巢癌[12]、前列腺癌[13]、膽囊腺癌[14]、食管癌[15]、膀胱癌[16]、非小細胞肺癌[17]和胃癌[18]等實體腫瘤組織中高表達。HMGA2可上調細胞周期蛋白的表達，加速G2/M期轉化，促使腫瘤發生、發展[19]。Morishita等[20]發現HMGA2可激活TGF-β信號通路促進EMT，增強腫瘤細胞的侵襲和轉移能力。目前研究已經證實下調骨肉瘤細胞中HMGA2的表達能夠明顯抑制骨肉瘤細胞的增殖[21]。本研究結果顯示miR-495 mimics+HMGA2組MG-63細胞中HMGA2蛋白相對表達量高于miR-495 mimics組，成功逆轉了miR-495對HMGA2蛋白的抑制作用，并且進一步通過CCK-8實驗證實轉染HMGA2表達質粒能夠明顯逆轉miR-495對MG-63細胞增殖的抑制作用，提示miR-495可能通過調控HMGA2的表達從而抑制骨肉瘤細胞的增殖能力。

通過上述實驗，我們發現骨肉瘤細胞中miR-495的表達水平低于正常成骨細胞，上調miR-495表達后骨肉瘤細胞增殖受到抑制，且miR-495可能通過靶向調控HMGA2表達從而抑制骨肉瘤細胞的增殖。