食管鱗癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液對(duì)正常CD3+CD56+NKT細(xì)胞亞型、表面受體及效應(yīng)分子表達(dá)的影響

鄭中龍，吳劍，戴天陽(yáng)

(1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000；2資陽(yáng)市人民醫(yī)院)

我國(guó)是食管癌高發(fā)國(guó)家，其中90%以上為食管鱗狀上皮細(xì)胞癌(簡(jiǎn)稱食管鱗癌)。食管鱗癌患者5年生存率僅為20%左右，腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是主要原因[1]。腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移需要逃避固有免疫和獲得性免疫系統(tǒng)的雙重監(jiān)視，但腫瘤細(xì)胞如何發(fā)生免疫逃逸仍未明確。研究[2]顯示，腫瘤細(xì)胞能夠調(diào)控組織浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的免疫活性，從而幫助自身逃避免疫監(jiān)視。自然殺傷T細(xì)胞(NKT細(xì)胞)是一類既表達(dá)NK細(xì)胞受體又表達(dá)T細(xì)胞受體的特殊淋巴細(xì)胞，同時(shí)具有NK細(xì)胞及T細(xì)胞的部分特征，在抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用[3]。CD3+CD56+NKT細(xì)胞活化后可直接作為效應(yīng)細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞，也能調(diào)節(jié)DC細(xì)胞、NK細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性，間接發(fā)揮抗腫瘤作用[4]。有文獻(xiàn)[5，6]報(bào)道，部分實(shí)體腫瘤組織中浸潤(rùn)的CD3+CD56+NKT細(xì)胞數(shù)量與患者預(yù)后呈正相關(guān)，提示CD3+CD56+NKT細(xì)胞在腫瘤免疫中具有重要作用。有臨床研究[7]表明外周血CD3+CD56+NKT細(xì)胞是食管癌免疫治療的候選方案。然而，食管癌微環(huán)境對(duì)CD3+CD56+NKT細(xì)胞功能的影響尚不清楚。本研究選用兩株侵襲能力不同的食管鱗癌細(xì)胞株Eca9706和Kyse150[8]的培養(yǎng)上清液模擬體外食管癌微環(huán)境，研究其對(duì)外周血CD3+CD56+NKT細(xì)胞的亞型、表面受體及效應(yīng)分子表達(dá)的影響，探討食管癌細(xì)胞逃脫機(jī)體免疫監(jiān)視的機(jī)制，為CD3+CD56+NKT細(xì)胞免疫治療的應(yīng)用提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要實(shí)驗(yàn)材料 食管鱗癌細(xì)胞株Eca9706、Kyse150均為西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保存。重組人IL-2購(gòu)自Peprotech公司。淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll400,1.077 kg/L)和胰蛋白酶購(gòu)自天津TBD公司。RPMI1640購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。DMSO購(gòu)自Sigma公司。培養(yǎng)瓶、6孔板、24孔板、15 mL離心管、50 mL離心管購(gòu)自康寧公司。抗CD3-FITC、CD56-APC、NKG2D-PERCP-CY5.5、NKG2A-PERCP、NKP30-PE、NKP44-PE、CD158b-PE、CD271-PE、CD4-PE、CD8-PERCP-CY5.5、穿孔素-PERCP-CY5.5、顆粒酶-PE及Ki-67-PE-CY7熒光抗體均購(gòu)自BD公司。CO2培養(yǎng)箱、離心機(jī)、倒置相差顯微鏡、超凈工作臺(tái)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)儀均由西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 外周血單核細(xì)胞的來(lái)源及分離方法 實(shí)驗(yàn)所用的正常人外周血來(lái)自30例西南醫(yī)科大學(xué)的健康志愿者，男18例、女12例，年齡21～25歲。分離方法：取正常人外周靜脈抗凝血3 mL，用淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)方法分離外周血單核細(xì)胞。加5倍無(wú)菌PBS液于單核細(xì)胞中，以1 200 r/min離心6 min，快速傾出上清液。用無(wú)菌PBS重懸細(xì)胞，吹打均勻后分為三等份，備用。

1.3 食管鱗癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液的制備[9]用含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)Eca9706、Kyse150細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁達(dá)70%～80%時(shí)換新鮮的培養(yǎng)基，24～48 h后收集上清液，離心備用。將上清液、含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基按1∶1混合以配制條件培養(yǎng)基。

1.4 外周血單核細(xì)胞分組與食管鱗癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液用法 將外周血單核細(xì)胞分為對(duì)照組、Eca9706組、Kyse150組。對(duì)照組細(xì)胞僅用含100 U/mL IL-2、10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)；Eca9706組、Kyse150組細(xì)胞加入100 U/mL的IL-2刺激24 h后，分別更換“1.3”中獲得的條件培養(yǎng)基(Eca9706細(xì)胞培養(yǎng)上清液、Kyse150細(xì)胞培養(yǎng)上清液)培養(yǎng)48 h，收集各組細(xì)胞。

1.5 各組CD3+CD56+NKT細(xì)胞亞型檢測(cè) 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。選擇CD3+CD56+的細(xì)胞群設(shè)計(jì)分析，各組細(xì)胞培養(yǎng)72 h后離心收集細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，取1×106個(gè)細(xì)胞至1.5 mL的EP管中，調(diào)節(jié)終體積至100 μL，按照抗體說(shuō)明書加入適量抗CD3-FITC、CD56-APC、CD4-PE、CD8-PERCP-CY5.5熒光標(biāo)記抗體，室溫避光孵育20 min。PBS溶液洗2次，1 200 r/min離心6 min收集細(xì)胞。用200 μL的PBS溶液重懸標(biāo)記后的細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.6 各組CD3+CD56+NKT細(xì)胞表面受體檢測(cè) 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。選擇CD3+CD56+的細(xì)胞群設(shè)計(jì)分析，各組細(xì)胞培養(yǎng)72 h后離心收集細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，取1×106個(gè)細(xì)胞至1.5 mL的EP管中，調(diào)節(jié)終體積至100 μL，按照抗體說(shuō)明書加入適量熒光標(biāo)記抗體，室溫避光孵育20 min。PBS溶液洗2次，1200 r/min離心6 min收集細(xì)胞。用200 μL的1×PBS溶液重懸標(biāo)記后的細(xì)胞，檢測(cè)各組細(xì)胞中CD3+CD56+NKT細(xì)胞的表面受體NKG2D、NKG2A、NKP30、NKP44、CD158b、CD271，每次檢測(cè)3～5個(gè)指標(biāo)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.7 各組CD3+CD56+NKT細(xì)胞效應(yīng)分子檢測(cè) 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。選擇CD3+CD56+的細(xì)胞群設(shè)計(jì)分析，各組細(xì)胞培養(yǎng)72 h后離心收集細(xì)胞，取2×106個(gè)細(xì)胞至1.5 mL的EP管中，調(diào)節(jié)終體積至100 μL，按照抗體說(shuō)明書加入適量抗CD3-FITC、CD56-APC，室溫避光孵育20 min。打孔緩沖溶液洗1次，1 200 r/min離心6 min收集細(xì)胞，加入打孔液-4 ℃避光孵30 min，打孔緩沖溶液洗1次，1 200r/min離心6 min收集細(xì)胞調(diào)節(jié)終體積至100 μL，按照抗體說(shuō)明書加入適量穿孔素-PERCP-CY5.5、顆粒酶-PE及Ki-67-PE-CY7熒光抗體，室溫避光孵育20min。PBS溶液洗2次，1 200 r/min離心6 min收集細(xì)胞。用200 μL的PBS溶液重懸標(biāo)記后的細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

2 結(jié)果

2.1 各組CD3+CD56+NKT細(xì)胞的不同亞型所占比例比較 Eca9706組及Kyse150組的CD3+CD56+NKT細(xì)胞中CD4+CD8-NKT細(xì)胞比例高于對(duì)照組，CD4-CD8-NKT細(xì)胞比例低于對(duì)照組(P均<0.05)。詳見表1。

表1 各組CD3+CD56+NKT細(xì)胞的不同亞型所占比例比較

2.2 各組CD3+CD56+NKT細(xì)胞表面受體表達(dá)率比較 Eca9706組、Kyse150組的CD3+CD56+NKT細(xì)胞中NKG2A、CD158b表達(dá)率高于對(duì)照組，NKP44、NKP30、CD271表達(dá)率低于對(duì)照組(P均<0.05)。詳見表2。

表2 各組CD3+CD56+NKT細(xì)胞表面受體表達(dá)率比較

2.3 各組CD3+CD56+NKT細(xì)胞中效應(yīng)分子表達(dá)比較 Eca9706組的CD3+CD56+NKT細(xì)胞中穿孔素表達(dá)率低于對(duì)照組(P<0.05)；Eca9706組的CD3+CD56+NKT細(xì)胞中Ki-67表達(dá)率高于對(duì)照組(P<0.05)。見表3。

表3 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組CD3+CD56+NKT細(xì)胞效應(yīng)分子比較

3 討論

現(xiàn)有研究表明，腫瘤在侵襲轉(zhuǎn)移過程中可通過調(diào)控免疫細(xì)胞活性來(lái)逃避機(jī)體免疫監(jiān)視。NKT細(xì)胞兼顧固有免疫和獲得性免疫特性，在腫瘤免疫監(jiān)視中具有重要作用，是免疫治療研究的熱點(diǎn)。NKT細(xì)胞表面的分子表型以CD3和CD56雙陽(yáng)性為特征，根據(jù)是否表達(dá)CD4和CD8分子，將成熟的CD3+CD56+NKT細(xì)胞分為CD4+CD8-NKT細(xì)胞、CD4-CD8-NKT細(xì)胞及CD4-CD8+NKT細(xì)胞三種亞型[10]。不同亞型的NKT細(xì)胞在腫瘤免疫中具有不同的功能，能夠通過Th1型細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-12)途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，也能通過Th2型細(xì)胞因子(IL-13、IL-4)途徑抑制機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫監(jiān)視[11]。正常人外周血淋巴細(xì)胞中CD3+CD56+NKT細(xì)胞以CD4-CD8+NKT細(xì)胞亞群為主[12]，而CD4-CD8+NKT細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷起重要作用[13]。Gumperz等[14]研究發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)CD4+CD8-NKT細(xì)胞可表達(dá)Th1型及Th2型細(xì)胞因子，而CD4-CD8-NKT與CD4-CD8+NKT細(xì)胞只表達(dá)Th1型細(xì)胞因子，所以CD4-CD8-NKT細(xì)胞及CD4-CD8+NKT發(fā)揮積極抗腫瘤的作用，而CD4+CD8-NKT胞則具有抑制腫瘤免疫監(jiān)視的作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在小鼠結(jié)腸癌肺轉(zhuǎn)移模型中，腫瘤的生長(zhǎng)與NKT細(xì)胞所表達(dá)的Th1型細(xì)胞因子水平具有很強(qiáng)的相關(guān)性；而在纖維肉瘤模型中，CD4+CD8-NKT細(xì)胞所分泌的IL-13是其復(fù)發(fā)的前提[15]。謝澎等[10]認(rèn)為在甲狀腺乳頭狀癌中，CD4+CD8-NKT細(xì)胞通過分泌IL-13引起了腫瘤的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，Eca9706組及Kyse150組的CD3+CD56+NKT細(xì)胞中CD4+CD8-NKT細(xì)胞比例高于對(duì)照組，CD4-CD8-NKT細(xì)胞比例低于對(duì)照組，表明食管鱗癌細(xì)胞株的培養(yǎng)上清液使CD4-CD8-NKT細(xì)胞比例降低，而CD4+CD8-NKT細(xì)胞比例增加，提示食管鱗癌細(xì)胞株的培養(yǎng)上清液減弱了CD3+CD56+NKT細(xì)胞的抗腫瘤作用，增強(qiáng)了其抑制腫瘤免疫監(jiān)視的作用。

NKT細(xì)胞表面表達(dá)與NK細(xì)胞類似的活化型受體和抑制型受體，兩種受體的表達(dá)失衡可導(dǎo)致NKT細(xì)胞活化或抑制。研究[16]表明，腫瘤細(xì)胞可分泌多種免疫抑制性細(xì)胞因子來(lái)調(diào)控NKT細(xì)胞相關(guān)受體的表達(dá)，從而影響NKT細(xì)胞的免疫活性，使腫瘤細(xì)胞更易發(fā)生免疫逃逸。彭六生等[5]研究發(fā)現(xiàn)胃癌微環(huán)境中CD3+CD56+NKT細(xì)胞的表面活化性受體NKG2D表達(dá)明顯降低。本研究中，食管鱗癌細(xì)胞株培養(yǎng)上清使CD3+CD56+NKT細(xì)胞表面受體NKG2A、CD158b表達(dá)率增加，而NKP44、NKP30、CD271表達(dá)降低。NKG2A是NKT細(xì)胞的抑制型受體，其主要配體是人白細(xì)胞抗原E(HLA-E)，高表達(dá)的HLA-E與抑制型受體NKG2A結(jié)合，產(chǎn)生負(fù)調(diào)節(jié)信號(hào)，從而抑制NKT細(xì)胞的殺傷能力[17]。CD158b也是NKT細(xì)胞表面的抑制型受體，因此推測(cè)食管鱗癌細(xì)胞株培養(yǎng)上清液可以使CD3+CD56+NKT細(xì)胞表面的抑制型受體表達(dá)上調(diào)從而抑制NKT細(xì)胞的殺傷能力。NKP44、NKP30、CD271是NKT細(xì)胞表面的活化型受體，CD271表達(dá)強(qiáng)度越低，腫瘤就越易浸潤(rùn)性生長(zhǎng)和發(fā)生轉(zhuǎn)移[18]。在正常情況下，CD3+CD56+NKT細(xì)胞表面的活化型受體和抑制型受體表達(dá)趨于平衡，本研究結(jié)果表明，食管鱗癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液可使CD3+CD56+NKT細(xì)胞表面活化型受體表達(dá)下調(diào)，而抑制性受體表達(dá)上調(diào)，使二者的表達(dá)比例失衡，從而降低CD3+CD56+NKT細(xì)胞的免疫活性，以便于腫瘤細(xì)胞逃避CD3+CD56+NKT細(xì)胞的殺傷，發(fā)生免疫逃逸，這與相關(guān)研究[16]的結(jié)果一致。

NKT細(xì)胞激活后能直接通過穿孔素、顆粒酶殺傷腫瘤細(xì)胞[19]，而CD3+CD56+NKT細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷主要是通過穿孔素途徑[20]。我們的研究發(fā)現(xiàn)食管癌細(xì)胞株培養(yǎng)上清液可使CD3+CD56+NKT細(xì)胞中的穿孔素表達(dá)下調(diào)，故我們認(rèn)為食管鱗癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液可通過下調(diào)CD3+CD56+NKT細(xì)胞中穿孔素的表達(dá)來(lái)降低NKT細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。本研究結(jié)果還顯示，ECa9706組的CD3+CD56+NKT細(xì)胞中Ki-67表達(dá)較對(duì)照組增強(qiáng)。Ki-67是反映細(xì)胞增殖能力的分子，表明食管鱗癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液有促進(jìn)CD3+CD56+NKT細(xì)胞增殖的能力。馮偉華等[21]研究發(fā)現(xiàn)，CD3+CD56+NKT細(xì)胞在實(shí)體惡性腫瘤和非實(shí)體惡腫瘤患者外周血中均明顯增加。謝澎等[10]發(fā)現(xiàn)在甲狀腺乳頭狀癌患者CD4+CD8-NKT細(xì)胞比例明顯高于健康人，而抗腫瘤作用的CD4-CD8+NKT細(xì)胞比例無(wú)變化。本研究還發(fā)現(xiàn)，Eca9706組、Kyse150組的CD3+CD56+NKT細(xì)胞中穿孔素及Ki-67的表達(dá)情況存在差異，具體的原因?qū)⒃诤罄m(xù)研究中進(jìn)一步分析。

結(jié)合以上研究結(jié)果，我們認(rèn)為，食管鱗癌細(xì)胞株培養(yǎng)上清液能改變正常CD3+CD56+NKT細(xì)胞的亞型，使細(xì)胞表面活化型受體和抑制型受體表達(dá)比例失衡，并下調(diào)效應(yīng)分子穿孔素的表達(dá)，使CD3+CD56+NKT細(xì)胞的免疫監(jiān)視功能受損。上述變化可能是食管鱗癌細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視的機(jī)制之一。