雷帕霉素對甲狀腺癌細胞株K1的增殖、遷移能力影響及其機制

趙永魁，王曉濤，陳建立，王長友，張國志

(華北理工大學附屬醫院，河北唐山063000)

甲狀腺癌是內分泌系統最常見的惡性腫瘤，其中甲狀腺乳頭狀癌是最常見的一種類型，約占80%。近年來我國甲狀腺癌發病率持續上升，是增長速度最快的惡性腫瘤[1]。目前針對分化較好、無淋巴結轉移的甲狀腺癌，主要是通過手術聯合131I放療及內分泌治療，可獲得較好的預后[2]。然而對已發生131I耐受或遠處轉移的乳頭狀癌、未分化癌和髓樣癌來說，傳統治療效果不佳[3]。同時手術治療可能存在神經副損傷及術后瘢痕影響美觀等不足。因此，甲狀腺癌藥物治療相關研究具有較大的臨床意義及前景。甲狀腺癌的發病機制尚不明確，有研究表明與細胞自噬有關[4]。自噬是細胞利用自噬-溶酶體系統對受損或壞死細胞器進行水解，將分解所得到的產物供細胞再利用的過程。自噬對細胞生長發育、維持內環境穩定具有重要意義，同時也與疾病的發生有關[5]。大量文獻[6]表明，自噬功能障礙與腫瘤細胞的發生、發展密切相關。雷帕霉素是一種真核生物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制劑，可通過抑制mTOR誘發自噬而發揮抗腫瘤作用[7]。3-甲基腺嘌呤(3-MA)作為自噬經典抑制劑，可通過對PI3K的作用影響自噬體形成，阻斷自噬[8]。本研究觀察了雷帕霉素作用后人甲狀腺乳頭狀癌K1細胞增殖、遷移能力變化，并觀察了自噬相關蛋白LC3、p62的表達情況，為闡明自噬與甲狀腺癌的關系及雷帕霉素在甲狀腺癌治療中的運用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 甲狀腺乳頭狀癌K1細胞購自中國科學院干細胞庫。RPMI-1640培養基、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司。雷帕霉素、3-MA購自北京索萊寶公司。兔抗人p62抗體、LC3抗體購自美國Abcam公司。辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗、GAPDH抗體、MTT細胞增殖毒性檢測試劑盒、聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒、電化學發光免疫分析儀(ECL)均購自上海碧云天生物技術研究所。酶標儀、濕轉系統購自上海Bio-Rad公司。12孔Transwell小室購自北京索萊寶公司。

1.2 雷帕霉素溶液、3-MA溶液的配制及適宜作用濃度篩選 ①雷帕霉素溶液配制：按說明書用二甲基亞砜(DMSO)將雷帕霉素配制成濃度為100 mmol/L的溶液，使用前用不含FBS的培養基RPMI1640稀釋成濃度為100 μmol/L的溶液。②3-MA溶液配制：按說明書用DMSO將3-MA溶解，配制成濃度為200 mmol/L的溶液備用。③雷帕霉素適宜作用濃度篩選：K1細胞用含10% FBS的RPMI1640培養基在37℃、5% CO2恒溫箱中培養；取生長狀態良好的細胞用0.25%胰酶消化制成1×105/mL的細胞懸液，每孔加入100 μL接種于96孔板，分為A、B、C、D、E、F組，每組設4個復孔；24 h后更換培養基，A組加入100 μL的培養基，B組加入99 μL培養基+1 μL雷帕霉素，C組加入95 μL培養基+5 μL雷帕霉素，D組加入90 μL培養基+10 μL雷帕霉素，E組加入85 μL培養基+15 μL雷帕霉素，F組加入80 μL培養基+20 μL雷帕霉素；培養24 h后每孔加入10 μL的MTT溶液(5 mg/mL)，繼續在培養箱中反應4 h，棄培養基，每孔加入100 μL的DMSO，置于培養箱中反應15 min，應用酶標儀在570 nm波長處測定各孔的吸光度值(OD值)。結果顯示不同濃度雷帕霉素對K1細胞增殖均有抑制作用，且隨著雷帕霉素濃度升高，細胞存活率逐漸降低。以時間為橫軸、以細胞存活率為縱軸繪制細胞存活曲線。利用存活曲線得出雷帕霉素半抑制濃度(IC50)為10 μmol/L，以此作為實驗濃度。為保證3-MA對細胞無毒性作用，要求3-MA終濃度為1 mmol/L。

1.3 細胞分組及處理 取生長狀態良好的K1細胞用0.25%胰酶消化制成密度為1×105/mL的細胞懸液，每孔取2 mL細胞懸液接種于3個6孔板，繼續培養，待細胞密度達80%開始實驗。將K1細胞分為對照組、雷帕霉素組、雷帕霉素+3-MA組。對照組不做任何處理，加入2 mL培養基；雷帕霉素組加入100 μmol/L雷帕霉素0.2 mL及培養基1.8 mL；雷帕霉素+3-MA組先加入100 μmol/L雷帕霉素200 μL及培養基1.79 mL，1 h后加入1 mmol/L 3-MA溶液10 uL。上述各組細胞繼續置于恒溫箱中培養24 h。

1.4 各組細胞增殖能力檢測 采用MTT法。取各組生長狀態良好的細胞，用0.25%胰酶消化制成密度為1×105/mL的細胞懸液，每孔加入100 μL接種于4個96孔板，每組取4個復孔。置于恒溫箱中培養，分別于24、48、72、96 h后每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)10 μL，繼續在培養箱中反應4 h，棄培養基，每孔加入DMSO 100 μL，置于培養箱中反應15 min，用酶標儀在570 nm波長處測定各孔的OD值，代表細胞增殖能力。

1.5 各組細胞遷移能力檢測 采用Transwell法。取各組生長狀態良好的細胞，用0.25%胰酶消化，用不含FBS培養基稀釋成密度為2×106/mL的細胞懸液。取100 μL的細胞懸液加入Transwell上室內，下室加入高濃度FBS(20%)培養基800 mL，置恒溫箱中培養。24 h后取出小室，用小刀將膜取下，穿過細胞膜的細胞細胞用HE染色。100倍顯微鏡下隨機挑選5個視野，計數穿膜細胞數。

1.6 各組細胞中LC3、p62蛋白檢測 采用Western blotting法。提取各組細胞細胞蛋白經定量、變性后于-80 ℃冰箱保存備用。按試劑盒說明配制12%分離膠、6%濃縮膠，蛋白上樣量40 μg，90 V恒壓電泳1 h，采用恒壓濕轉(p62蛋白為90 V、60 min，LC3蛋白為90 V、20 min)。配制10%脫脂牛奶，將膜置于10%脫脂牛奶中搖床封閉2 h，加入一抗(1∶1 000)4 ℃搖床孵育過夜，TBST溶液洗膜3次、每次10 min，加入二抗(1∶1 000)室溫 2 h，TBST溶液洗膜3次、每次10 min，ECL熒光顯色。采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。以目的蛋白灰度值與內參GAPDH蛋白灰度值的比值表示目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 各組細胞增殖能力比較 培養48、72、96 h后，雷帕霉素組細胞增殖能力低于對照組，雷帕霉素+3-MA組細胞增殖能力高于雷帕霉素組(P均<0.01)。詳見表1。

表1 各組細胞OD值比較

注：與對照組相比，*P<0.01；與雷帕霉素組相比，#P<0.01。

2.2 各組細胞侵襲能力比較 對照組、雷帕霉素組、雷帕霉素+3-MA組穿膜細胞數為分別為(310.4±5.7)、(100.4±4.5)、(292.2±4.6)個/視野，雷帕霉素組穿膜細胞數少于對照組，雷帕霉素+3-MA組穿膜細胞數多于雷帕霉素組(P均<0.01)。見圖1。

圖1 各組穿膜細胞情況

2.3 各組細胞中p62、LC3蛋白表達比較 對照組、雷帕霉素組及雷帕霉素+3-MA組中p62蛋白相對表達量分別為1.215±0.106、0.232±0.025、0.876±0.054，LC3蛋白相對表達量分別為0.091±0.012、1.980±0.095、0.363±0.058。雷帕霉素組LC3蛋白相對表達量高于對照組，p62蛋白相對表達量低于對照組(P均<0.01)；雷帕霉素+3MA組LC3蛋白相對表達量低于雷帕霉素組，p62蛋白相對表達量高于雷帕霉素組(P均<0.01)。見圖2。

圖2 各組細胞中LC3、p62蛋白電泳條帶

3 討論

甲狀腺癌是臨床上常見的惡性腫瘤，以女性多見，男女發病比例1∶3。有研究[4]表明甲狀腺癌的發病與細胞自噬有關。細胞自噬功能近年來受到了較多關注。自噬通過去除功能失調或受損的細胞成分并回收必需的細胞成分，在穩態的維持中發揮重要作用[10]。自噬功能障礙與腫瘤細胞的發生、發展密不可分[6]。自噬在惡性腫瘤發生發展中呈現雙重作用：在高度侵襲性惡性腫瘤中，僅通過血管生成和有氧糖酵解是無法滿足惡性腫瘤的高代謝，因此需激活替代代謝途徑，通過自噬被循環以提供細胞能量來源[11]；然而，隨著細胞成分逐漸消耗，無限制的自噬最終導致細胞死亡[12]。因此，自噬既可以維持腫瘤細胞的生長和發展，也可以因自噬作用過度引起“自噬性死亡”從而抑制腫瘤細胞生長[13,14]。

雷帕霉素是真核生物mTOR最常見的抑制劑。mTOR是調節細胞生長和周期的關鍵蛋白，可通過磷酸化核糖體激酶S6K和真核生物起始因子4E-BP1從而促進細胞生長。當mTORC1活性被抑制后，下游分子4E-BP1和S6K被抑制，cyclin D1、HIF-1活性降低，抑制細胞周期、細胞生長和新血管生成[15]。Liu等[16]發現雷帕霉素可對骨肉瘤細胞生長產生抑制作用。研究[17]表明，在很多腫瘤細胞中存在編碼mTOR蛋白基因突變，使腫瘤細胞中mTOR過度表達。在甲狀腺癌細胞的生長、增殖過程中，PI3K-AKT-mTOR信號通路發揮重要作用[18]。本研究結果顯示，培養48、72、96 h后，雷帕霉素組細胞增殖能力低于對照組，雷帕霉素+3-MA組細胞增殖能力高于雷帕霉素組；雷帕霉素組穿膜細胞數少于對照組，雷帕霉素+3-MA組穿膜細胞數多于雷帕霉素組。上述結果表明雷帕霉素對甲狀腺癌細胞的增殖、遷移能力有抑制作用。有報道[19]稱，mTOR具有抑制自噬等功能。Eum等[20]研究發現雷帕霉素發揮抗腫瘤作用是通過抑制mTOR誘發自噬來完成的。因此推測雷帕霉素對K1細胞增殖、遷移能力的抑制作用可能與自噬有關。

3-MA是自噬經典抑制劑[8]。在實驗過程中，我們發現加入3-MA后細胞增殖能力及遷移能力均較雷帕霉素組明顯增強，進一步提示雷帕霉素抑制K1細胞增殖、遷移能力與自噬有關。在涉及自噬過程的各種蛋白中，LC3參與延伸并促成自噬體形成[11]；p62是一種自噬特異性底物，可將泛素化蛋白轉移至自噬體[21]，其蛋白序列上有一特殊區域能夠被LC3識別，其與LC3相互作用不斷被自噬-溶酶體系統降解[22]。因此LC3、p62是目前觀察自噬現象是否存在較為可靠的生物學標志物。我們進一步檢測了各組細胞中自噬相關蛋白的表達情況，發現雷帕霉素組LC3蛋白相對表達量高于對照組，p62蛋白相對表達量低于對照組；雷帕霉素+3-MA組LC3蛋白相對表達量低于雷帕霉素組，p62蛋白相對表達量高于雷帕霉素組。上述結果提示雷帕霉素作用后細胞自噬增強，而加入自噬抑制劑后細胞自噬被抑制，進一步驗證了上述結論。

綜上所述，雷帕霉素作用后甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖、遷移能力受到抑制，其機制可能與誘發自噬有關，具體機制有待進一步研究證實。