胡蘿卜苷對人肝癌細(xì)胞株HepG2增殖、凋亡的影響及其機(jī)制探討

曾俊權(quán)，林曄，劉婷婷，柯波，肖游章

(1井岡山大學(xué)，江西吉安343009；2贛州市人民醫(yī)院；3江西省人民醫(yī)院)

肝癌是一種常見的惡性腫瘤，病死率很高[1]。探索肝癌防治方案成為國內(nèi)研究的熱點(diǎn)[2]。近年來研究[3]發(fā)現(xiàn)，多種中藥的天然有效成分及其提取物在腫瘤等疾病的治療中發(fā)揮了積極作用。胡蘿卜苷是一種從中藥材望江南中提取出的具有抗肝癌作用的活性單體之一，其具體抗肝癌機(jī)制尚未明確[4]。我們前期研究[5]發(fā)現(xiàn)胡蘿卜苷可能通過下調(diào)TOPOⅠ、TOPOⅡ基因表達(dá)而抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖。Wnt/β-catenin信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，參與了許多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6]，該通路在部分肝癌病例中呈活化狀態(tài)[7]。有研究[8]表明Wnt/β-catenin信號通路的異常活化可能是β-catenin基因突變所致。本研究觀察了胡蘿卜苷對肝癌細(xì)胞株HepG2增殖和凋亡的影響，及對Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，探討胡蘿卜苷可能的抗癌機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 HepG2細(xì)胞由廣州萊德爾生物科技有限公司實(shí)驗(yàn)室傳代和保存。胡蘿卜苷購于Sigma公司。胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、青-鏈霉素和PBS購于Hyclone公司。細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)皿等購于CORNING公司。Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于Keygen公司。HRP標(biāo)記的GAPDH內(nèi)參購于上海康成生物有限公司。羊抗兔標(biāo)記HRP二抗購于Southern Biotech公司。Bax、Bcl-2、WNT3A和β-catenin抗體購于Abcam公司。倒置光學(xué)顯微鏡購于OLYMPUS公司。CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱、DMI6000B酶標(biāo)儀購于賽默飛世爾(上海)儀器有限公司。垂直電泳槽、轉(zhuǎn)移電泳槽購于上海天能科技有限公司。流式細(xì)胞儀購于BD Calibur公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 HepG2細(xì)胞按1×105/mL接種于含10%胎牛血清并加入青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將HepG2細(xì)胞分為胡蘿卜苷組和對照組。

1.3 細(xì)胞增殖能力觀察 選取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞用trypsin-EDTA進(jìn)行消化處理，離心后計(jì)數(shù)，按5×105/mL接種于96孔板中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h。胡蘿卜苷組分別加入25、50、100、150、200 μg/mL的胡蘿卜苷，對照組不加入藥物。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔中加入10 μL的CCK-8試劑，培養(yǎng)1 h后用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的OD值，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值)×100%。

1.4 細(xì)胞凋亡情況觀察 取對數(shù)生長期的肝癌HepG2細(xì)胞，按5×105/mL接種于6孔板中。胡蘿卜苷組分別加入50、100 μg/mL的胡蘿卜苷，對照組不加入藥物。在37 ℃、5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)液，PBS清洗1次，加入0.5 mL的0.25%胰酶消化，待細(xì)胞消化完全后加入預(yù)冷的結(jié)合緩沖液吹打成單個(gè)細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL。取0.5 mL細(xì)胞懸液，加入1.25 μL的Annexin V-FITC，室溫避光反應(yīng)15 min，離心棄上清。加入0.5 mL預(yù)冷的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，并加入10 μL的Propidium Iodide，室溫避光孵育，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.5 細(xì)胞中Bax、Bcl-2、WNT3A、β-catenin蛋白檢測 取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，按5×105/mL接種于6孔板中。胡蘿卜苷組分別加入50、100 μg/mL的胡蘿卜苷，對照組不加入藥物。于37 ℃、5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞并提取細(xì)胞全蛋白，用BCA法對蛋白濃度進(jìn)行定量。取20 μg的蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，于5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h；4 ℃條件下一抗孵育過夜，次日將膜用TBST漂洗4次、每次10 min；用HPR二抗室溫振蕩孵育2 h；TBST漂洗4次、每次10 min；配置化學(xué)發(fā)光反應(yīng)液、曝光、顯影，用Quantity One凝膠圖像分析軟件分析目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶的光密度比值，代表目的蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞增殖抑制率比較 胡蘿卜苷組中25、50、100、150、200 μg/mL亞組細(xì)胞增殖抑制率分別為18.0%±2.7%、28.0%±2.1%、42.0%±2.1%、45.6%±2.3%、48.0%±3.3%，對照組細(xì)胞增殖抑制率為0，胡蘿卜苷各亞組細(xì)胞增殖抑制率均高于對照組，且胡蘿卜苷組中25、50、100、150、200 μg/mL亞組細(xì)胞增殖抑制率依次增高(P均<0.05)。

2.2 兩組細(xì)胞凋亡率比較 胡蘿卜苷組50 μg/mL亞組、100 μg/mL亞組細(xì)胞凋亡率均高于對照組，且100 μg/mL亞組細(xì)胞凋亡率高于50 μg/mL亞組(P均<0.05)。見圖1、表1。

圖1 胡蘿卜苷組與對照組細(xì)胞凋亡情況

表1 胡蘿卜苷組與對照組細(xì)胞凋亡率比較

2.3 兩組細(xì)胞中Bax、Bcl-2、WNT3A和β-catenin蛋白表達(dá)比較 對照組及胡蘿卜苷組的50 μg/mL亞組、100 μg/mL亞組細(xì)胞中Bax蛋白相對表達(dá)量依次增高，Bcl-2、WNT3A、β-catenin蛋白相對表達(dá)量依次降低(P均<0.05)。詳見圖2、表2。

注：A為Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)情況；B為WNT3A、β-catenin蛋白表達(dá)情況。

表2 胡蘿卜苷組與對照組細(xì)胞中Bax、Bcl-2、WNT3A、β-catenin蛋白表達(dá)比較

3 討論

肝癌是一種高病死率的惡性腫瘤，傳統(tǒng)的手術(shù)切除治療、放療、化療都存在一定的弊端，并且治療后容易復(fù)發(fā)，對機(jī)體的繼發(fā)性損傷也很大。中醫(yī)中藥學(xué)在控制病情發(fā)展、改善癥狀體征及提高生存質(zhì)量等方面的優(yōu)勢日益顯現(xiàn)。許多中藥對腫瘤具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多效應(yīng)的作用[9]。發(fā)掘具有抗肝癌作用的中藥及闡明其相關(guān)作用機(jī)制已成為研究熱點(diǎn)。胡蘿卜苷是傳統(tǒng)常用中藥望江南中的一種活性單體。已有研究[5]表明，胡蘿卜苷能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移。胡蘿卜苷還可促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞發(fā)生線粒體依賴的細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G2/M期[10]，但具體機(jī)制尚不清楚。我們研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胡蘿卜苷處理肝癌HepG2細(xì)胞48 h后對細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，且隨著胡蘿卜苷濃度增加，抑制效應(yīng)越顯著。

細(xì)胞凋亡是一種由基因調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡過程，與細(xì)胞增殖共同維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)。本研究觀察了兩組細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，胡蘿卜苷對肝癌細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡都有促進(jìn)作用，說明胡蘿卜苷具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的作用。Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)過程中的重要蛋白。Bcl-2主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和核膜，通過抑制細(xì)胞色素C的釋放來抑制細(xì)胞凋亡。Bax通過轉(zhuǎn)位并緊密結(jié)合到線粒體膜上，從而使線粒體的結(jié)構(gòu)和功能受到破壞，誘導(dǎo)釋放細(xì)胞色素C及激活Caspase-8、Caspase-9，通過多種Caspase依賴的信號通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡[11]。因此，Bcl-2和Bax的相互作用對細(xì)胞凋亡起決定性作用[12]。有研究發(fā)現(xiàn)60%以上肝癌組織中出現(xiàn)Survivin和β-catenin蛋白的異常表達(dá)，并與原發(fā)性肝癌的發(fā)生有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，對照組及胡蘿卜苷組的50 μg/mL亞組、100 μg/mL亞組細(xì)胞中Bax蛋白相對表達(dá)量依次增高，Bcl-2蛋白相對表達(dá)量依次降低，提示胡蘿卜苷對HepG2細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)起促進(jìn)作用，而對Bcl-2的表達(dá)起抑制作用，可調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2平衡，這從蛋白水平驗(yàn)證了胡蘿卜苷能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡。

Wnt/β-catenin通路是細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要信號通路，也被稱為經(jīng)典Wnt通路[13]。Wnt/β-catenin信號通路異常與多種惡性腫瘤發(fā)生及發(fā)展有著密切關(guān)系[14]。活化后Wnt蛋白會破壞β-catenin的降解復(fù)合體，抑制β-catenin的降解過程，導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)堆積，還能促進(jìn)β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核[15]，β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核后能夠調(diào)節(jié)多種靶基因的表達(dá)，如c-Myc、Survivin和Cyclin D1[16]。根據(jù)研究統(tǒng)計(jì)，至少有90%的結(jié)直腸癌患者細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路異常[17]。有學(xué)者[18]發(fā)現(xiàn)卵巢癌細(xì)胞中Wnt-1、β-catenin蛋白異常高表達(dá)可能是卵巢癌晚期的重要標(biāo)志。β-catenin蛋白在多種鼻咽癌細(xì)胞中異常高表達(dá)，與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系[19]。國內(nèi)學(xué)者[20]發(fā)現(xiàn)，通過上調(diào)P53蛋白表達(dá)，可抑制膽管癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin通路相關(guān)分子及其下游Notch信號分子的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡，同時(shí)也導(dǎo)致Bax/Bcl-2升高。我們對Wnt/β-catenin信號通路中的WNT3A和β-catenin蛋白進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)對照組及胡蘿卜苷組的50 μg/mL亞組、100 μg/mL亞組細(xì)胞中WNT3A、β-catenin蛋白相對表達(dá)量依次降低，提示胡蘿卜苷對WNT3A和β-catenin蛋白的表達(dá)起抑制作用，進(jìn)而抑制Wnt/β-catenin信號通路的功能。Survivin是一種凋亡抑制因子[21]，可通過抑制Caspase活性發(fā)揮抗凋亡作用，而Survivin的表達(dá)受Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)節(jié)，但是胡蘿卜苷對Survivin表達(dá)的影響尚不明確。

綜上所述，胡蘿卜苷對HepG2細(xì)胞的增殖具有抑制作用，而對其凋亡具有促進(jìn)作用，其機(jī)制可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路和促進(jìn)凋亡蛋白表達(dá)有關(guān)。然而，胡蘿卜苷具體的抗腫瘤機(jī)制尚未完全闡明，還需進(jìn)一步研究確定其體內(nèi)抗腫瘤活性。