X線照射對NSCLC細胞株吉非替尼獲得性耐藥的體外逆轉作用觀察

程燕君，謝波，張為民

(1廣東藥科大學，廣州510006；2廣州軍區廣州總醫院)

以吉非替尼為代表的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)是EGFR突變型非小細胞肺癌(NSCLC)的一線治療藥物。然而，接受EGFR-TKI治療的患者不可避免地會產生獲得性耐藥，中位無進展生存期(PFS)僅為10～12個月[1～3]。目前耐藥后的策略主要是換用新一代靶向藥物及化療[4～6]，但靶向藥物仍面臨再次耐藥的問題，而化療藥物缺乏靶向性，不良反應明顯。因此，尋找克服EGFR-TKI耐藥的策略是臨床亟待解決的問題。研究[7]表明，EGFR-TKI耐藥的患者在放療后繼續行EGFR-TKI治療有助于提高PFS及OS，提示放療可能逆轉了EGFR-TKI的獲得性耐藥。既往基礎研究[8]也顯示，放射線可逆轉EGFR基因第21外顯子突變細胞對吉非替尼的獲得性耐藥，且發現伴21外顯子突變的獲得性耐藥細胞在放射線照射后發生了間質-上皮轉化(MET)。EGFR基因第19外顯子突變亦為常見經典突變。對于放射線可否通過MET逆轉EGFR基因第19外顯子突變的NSCLC細胞對EGFR-TKI的獲得性耐藥目前未見報道。本研究選取EGFR基因第19外顯子突變的NSCLC細胞株PC-9，用吉非替尼誘導產生獲得性耐藥細胞株PC-9/AB，觀察X線對NSCLC細胞株吉非替尼獲得性耐藥的體外逆轉作用，現在報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要實驗材料 PC-9細胞購于中國科學院上海細胞庫。吉非替尼獲得性耐藥細胞株PC-9/AB為日本國立癌癥中心小泉史明博士惠贈。經檢測，PC-9、PC-9/AB細胞均伴EGFR基因第19外顯子缺失突變，PC-9/AB細胞攜帶T790M突變及EMT。配置RPMI1640完全培養基(包括10%標準胎牛血清、100 U/mL的青霉素和100 U/mL的鏈霉素)。PC-9、PC-9/AB細胞貼壁生長于含培養基的培養瓶，置于無菌孵箱(5% CO2、37 ℃、飽和濕度)中培養。

1.2 細胞分組與X線照射方法 PC-9細胞為對照組，PC-9/AB細胞分為耐藥組和實驗組。實驗組細胞鋪于25 cm2培養瓶里，用醫用直線加速器(CLINAC 600C/D，瓦里安公司)照射處于對數生長期的細胞；照射參數設置為6 mV X線、劑量率300 cGy/min、源皮距100 cm、照射角180°、照射野40 cm×40 cm、單次照射劑量6 Gy；細胞恢復穩定生長后再次進行照射，共照射4次(總劑量24 Gy)；細胞穩定生長后建成放射線照射細胞株，命名為PC-9/AB IR。

1.3 三組細胞對吉非替尼的敏感性觀察 取三組指數生長期細胞，胰酶消化，制成單細胞懸液并計數，將單細胞懸液按2×103/孔接種于96孔板中；細胞分別在含0、0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/L吉非替尼的培養基中培養；72 h后在避光條件下按CCK-8細胞計數試劑盒說明書加入預先配置好的CCK-8工作液；繼續孵育2 h，在全自動酶標分析儀(Biocell公司)上檢測波長為450 nm時的光密度值(OD值)。根據公式計算細胞在各個藥物濃度下的抑制率，并通過Graphpad Prime5軟件計算吉非替尼對細胞生長的IC50值。細胞生長抑制率=[1-(加藥組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%。

1.4 細胞放射敏感性觀察 取三組對數生長期細胞，0.25%胰酶消化，制成單細胞懸液并計數。將細胞分別接種于60 mm的細胞培養皿中進行X線照射，照射后的細胞繼續培養10～14 d。計數細胞數>50個的細胞集落數。按公式計算存活分數：貼壁率=對照組每孔克隆數/每孔細胞種植數×100%，存活分數=實驗組每孔克隆數/(每孔細胞種植數×貼壁率)。

1.5 細胞基因突變觀察 采用NGS法檢測295基因panel，觀察各組細胞突變情況。

1.6 細胞中E-cadherin、Vimentin蛋白檢測 采用Western blotting法。裂解液裂解每組細胞后離心15 min，根據BCA-200蛋白濃度測定法檢測蛋白濃度后加入上樣緩沖液，95 ℃變性5 min。SDS-PAGE電泳完成后，按下層厚濾紙、PVDF膜、膠、上層厚濾紙的順序進行轉膜30 min。37 ℃封閉2 h，于抗體孵育盒內孵育一抗(4 ℃過夜)。用5%脫脂奶粉分別將鼠抗人單克隆抗體E-cadherin vimentin β-actin稀釋，脫色搖床上孵育二抗1 h。PVDF膜避光條件下曝光后計算灰度值(Quantity One軟件)，代表目的蛋白表達量。

1.7 細胞凋亡率測算 胰酶消化各組細胞后，調整濃度重新接種恢復對數生長。三組細胞分別在含0、20、40、80 μmol/L吉非替尼的培養基中培養24h。根據細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天公司)說明先后加入Annexin V-FITC結合液、Annexin V-FITC、碘化丙啶染色液，室溫孵育10～20 min，在流式細胞儀上觀察凋亡細胞，并計算細胞凋亡率。

2 結果

2.1 各組細胞對吉非替尼的敏感性 不同濃度吉非替尼作用后各組細胞生長抑制率見表1。吉非替尼抑制對照組、耐藥組、實驗組細胞生長的IC50值分別為(0.05±0.03)、(16.01±3.42)、(0.28±0.01)μmol/L，其中實驗組IC50值低于耐藥組(P<0.05)。

表1 不同濃度吉非替尼作用后各組細胞生長抑制率

2.2 細胞放射敏感性 對克隆成型實驗結果以2 Gy下存活率比較。2 Gy、4 Gy、6 Gy劑量X線照射后實驗組細胞克隆存活率高于對照組(P均<0.05)；對照組、耐藥組、實驗組細胞的存活分數(2 Gy)分別為0.579±0.044、0.688±0.011、0.823±0.009，實驗組細胞存活分數高于耐藥組(P<0.05)，說明實驗組細胞較耐藥組細胞表現出明顯的放射線抵抗。

2.3 各組細胞基因突變情況 NGS測序結果顯示實驗組、耐藥組均為EGFR基因第19外顯子缺失突變細胞，且均攜帶T790M二次突變，均有TP53基因第7外顯子的缺失突變。各組細胞的ALK、ROS1等基因未見明確的突變、擴增、融合及拷貝數改變。

2.4 各組細胞中E-cadherin、vimentin蛋白表達比較 實驗組、耐藥組、對照組細胞中E-cadherin相對表達量分別為1.294±0.021、0.397±0.023、0.871±0.008，耐藥組低于對照組，實驗組高于耐藥組(P均<0.05)；實驗組、耐藥組、對照組細胞中vimentin相對表達量分別為(0、0.249±0.014、0)，耐藥組高于對照組，實驗組低于耐藥組(P均<0.05)。

2.5 各組細胞凋亡率比較 經吉非替尼作用，各組細胞均發生凋亡，作用呈濃度依賴性。20、40、80 μmol/L吉非替尼作用后，實驗組細胞凋亡率均高于耐藥組(P均<0.05)。詳見表2。

表2 不同濃度吉非替尼作用后各組細胞凋亡率

3 討論

本研究結果初步證實了X線照射可逆轉伴EGFR基因第19外顯子突變的PC-9/AB細胞對一代EGFR-TKI吉非替尼的耐藥。EGFR-TKI獲得性耐藥的機制包括二次突變、下游通路及旁路異常激活、小細胞肺癌轉化等[9]。其中T790M是一代EGFR-TKI繼發耐藥最主要的機制[10]，本實驗選取T790M突變所致伴EGFR基因第19外顯子突變的吉非替尼獲得性耐藥細胞株PC-9/AB為研究對象。經2Gy 劑量下X線照射后，實驗組細胞生長抑制率高于耐藥組，對放射線相對抵抗。耐藥組細胞T790M耐藥突變并未影響細胞的放射敏感性，但吉非替尼對實驗組細胞生長的IC50值較耐藥組細胞顯著降低，接近敏感突變的對照組細胞PC-9，表明放射線逆轉了PC-9/AB對吉非替尼的獲得性耐藥。張星南、李靜等[11,12]也發現電離輻射可逆轉伴T790M突變NSCLC細胞株PC-9/GR、NCI-H1975/GR對一代EGFR-TKI的獲得性耐藥。Van等[13]也支持這一結論，他們發現對EGFR-TKI耐藥的患者進行放療后重新給予EGFR-TKI治療，患者的PFS和OS得到不同程度的延長。

關于放射線逆轉腫瘤細胞對EGFR-TKI獲得性耐藥的機制目前尚不明確。放射線可通過使腫瘤細胞DNA斷裂、交聯等DNA損傷而致細胞死亡[14]。腫瘤細胞對EGFR-TKI的敏感性與基因狀況密切相關，攜帶EGFR基因第18、19、21外顯子突變的細胞對EGFR-TKI敏感，而對一代EGFR-TKI耐藥的NSCLC患者常攜帶有T790M等基因突變。放射線逆轉EGFR-TKI獲得性耐藥是否通過改變基因狀況得以實現值得探討。為明確這一問題，本研究用二代測序法觀察了各組細胞中的EGFR、ALK、ROS1等常見驅動基因突變情況，結果未見到明確的基因突變、擴增、融合及拷貝數變化。說明放射線逆轉T790M突變所致的繼發耐藥并非源于對常見驅動基因層面的改變。這與Wang等[8]的研究結果一致，他們通過HRMA法檢測亦未發現細胞在放射線照射后產生了新的突變。

研究[9]已證實NSCLC細胞對一代EGFR-TKI獲得性耐藥產生機制之一是細胞發生了EMT，而逆轉EMT可恢復對EGFR-TKI的敏感性。Suda等[15]用厄洛替尼誘導人肺腺癌細胞系HCC4006(攜帶EGFR基因第19外顯子缺失突變)獲得性耐藥過程中出現了EMT。Lee等[16]通過Snail蛋白、Slug蛋白誘導PC9、HCC827細胞發生EMT后，出現對吉非替尼耐藥；而逆轉EMT后，細胞對EGFR-TKI的敏感性恢復。在本研究中，耐藥組細胞中E-cadherin相對表達量低于對照組，實驗組E-cadherin相對表達量高于耐藥組；耐藥組細胞中vimentin相對表達量高于對照組，實驗組vimentin相對表達量低于耐藥組。上述結果表明放射線逆轉PC-9/AB的耐藥過程中出現了EMT的逆轉。EMT逆轉意味著腫瘤組織恢復了上皮組織特性，重新出現了EGFR-TKI的作用靶點，從而恢復了對吉非替尼的敏感性。這可能是放射線逆轉NSCLC細胞獲得性耐藥的機制之一，與Wang等[8]的研究結果一致。此外，我們還發現20、40、80 μmol/L吉非替尼作用后，實驗組細胞凋亡率均高于耐藥組，說明細胞凋亡可能參與了放射逆轉EGFR-TKI獲得性耐藥這一過程，具體的調控通路有待進一步的研究。

結合上述研究結果，我們認為，X線照射可以逆轉NSCLC細胞株對吉非替尼的獲得性耐藥，增強細胞對吉非替尼的敏感性，推測其機制可能與逆轉EMT及促進細胞凋亡有關。