地卓西平馬來酸鹽腹腔注射對大腦中動脈閉塞大鼠神經功能的影響及其機制

馬英，劉星，楊春壯，王子軒，雷瀛，王林林

(牡丹江醫學院，黑龍江牡丹江 157011)

腦血管病具有高發病率、病死率、致殘率、復發率的特點，對人類生命安全和健康造成嚴重的危害，臨床上以缺血性腦血管病多見。缺血性腦血管疾病多為局灶性，以大腦中動脈閉塞(MCAO)多見。部分梗塞患者由于溶栓治療或栓子自發向遠端推移，出現血管再通即再灌注現象。地卓西平馬來酸鹽(MK-801)是離子型谷氨酸受體拮抗劑，可阻斷N-甲基-D-門冬氨酸(NMDA)受體，明顯降低腦缺血再灌注引起的腦損傷。有研究認為，MK-801可降低Ca2+濃度，維持Ca2+在細胞內外的平衡，抑制興奮性氨基酸毒性，促進神經干細胞(NSCs)的增殖，同時抑制神經元的凋亡，在治療腦損傷、缺血性腦血管疾病、抗驚厥等方面發揮重要作用[1,2]。MK-801在腦缺血再灌注后對神經元的保護作用已得到初步證實，但其作用機制尚不明確。本研究觀察了MK-801對MCAO大鼠神經功能的影響，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取健康Wistar大鼠108只，雌雄各半，體質量200～350 g，由牡丹江醫學院醫藥研究中心提供，實驗動物許可證號為SYXX(黑)2015-007。

1.2 藥物、儀器及試劑 MK-801(美國Sigma公司)；Multiskan MK3酶標儀(Thermo熱電上海儀器有限公司)；神經生長因子β(NGFβ)酶聯免疫試劑盒(武漢博士德生物公司)；巢蛋白(NES)免疫組化試劑盒(武漢博士德生物公司)。

1.3 實驗動物分組、MCAO模型制備及MK-801給予方法 108只大鼠隨機分為藥物組、模型組、對照組各36只。藥物組、模型組均制備MCAO模型[3]，即大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)，仰臥并固定于鼠板上，在大鼠頸部前正中線縱行切口，長2.0～2.5 cm，鈍性分離筋膜、肌肉及甲狀腺腺體，注意減少刺激迷走神經，分離并結扎右側頸總動脈(CCA)，再穿一線備用。分離頸內動脈(ICA)和頸外動脈(ECA)，結扎ECA，用微動脈夾夾閉ICA，在近CCA分叉處剪一V形切口，將直徑為0.2～0.25 mm尼龍線頭端涂抹硅膠脂，沿CCA插入ICA，同時放開微動脈夾，輕輕牽拉使栓線進入顱腔，插入深度18～20 mm，稍遇阻力即停，說明線栓已阻斷大腦中動脈(MCA)的入口，造成MCA阻塞。將CCA上的備線扎緊，防止線栓滑出，縫合傷口，涂抹青霉素抗炎。1 h后，緩慢退出部分線栓進行再灌注。對照組只做手術暴露頸部動脈，結扎CCA，但不予線栓。制模后大鼠清醒后腹腔注射MK-801(用0.9%生理鹽水配置成濃度為0.06 mg/mL的溶液)，1次/d，給藥14 d；模型組和對照組腹腔注射等量生理鹽水。

1.4 大鼠神經功能評價 在制模第3、7、14 d大鼠處死前分別進行神經功能評分[4]。無神經功能缺損表現計0分，提尾懸空時左前爪不能伸展計1分，行走時向左側轉圈計2分，行走困難、并不時地向左側傾倒計3分，不能自主行走、意識下降計4分。

1.5 大鼠大腦皮質NGF、NES檢測 各組動物分別于制模第3、7、14 d禁食過夜，在每個時間點隨機選取8只處死，迅速在冰盤上修取MCA供血區(右側缺血側)的大腦皮質，用濾紙處理掉黏附的腦脊液和血液，稱重標記后按1∶9的比例配入冰生理鹽水，置于勻漿器勻漿，離心機以3 000 r/min離心30 min，取上清，采用ELISA法檢測NGF，結果以OD值表示。同時每組每個時間點將剩余4只進行常規灌注固定，取出大腦，取MCA供血區(右側缺血側)中間部分的大腦皮質，置于4%多聚甲醛固定液中，4 ℃浸潤固定，經石蠟包埋，連續冠狀切片(5 μm)，采用免疫組化法檢測NES，每例標本檢測4張切片，每張切片各取5個高倍視野(40×)，測定NES累積光密度值和總面積，把兩者的比值作為平均光密度值(IOD值)，最后計算每組動物的均值。

2 結果

2.1 各組制模3、7、14 d大鼠神經功能評分比較 結果見表1。

表1 各組大鼠制模3、7、14 d神經功能評分比較(分，

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

2.2 各組大鼠制模3、7、14 d大腦皮質NGF OD值比較 結果見表2。

表2 各組大鼠制模3、7、14 d大腦皮質NGF OD值比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

2.3 各組大鼠制模3、7、14 d腦皮質NES IOD值比較 結果見表3。

表3 各組大鼠制模3、7、14 d腦皮質NES IOD值比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

3 討論

缺血性腦血管病是指局部腦組織包括神經細胞、膠質細胞及聯系纖維由于供血障礙發生的變性、壞死或一過性的功能喪失。腦動脈一旦受到阻塞，腦組織就會以為沒有足夠的血液灌注，而引發腦血管缺血、缺氧，缺血性腦血管病的一系列生理、病理的演變過程也隨之開始，而這一演變過程的最終結果就是神經元死亡及神經功能缺損。缺血性腦血管病是一種常見病，發病后對患者造成的損傷很大，且很難徹底治愈，影響其發病的因素很多也很復雜。最常見的治療方法仍是藥物治療，因此如何合理地選擇治療的藥物已成為目前缺血性腦血管病討論的焦點。

腦缺血性損傷時，谷氨酸在突觸間隙中積聚，NMDA受體過度興奮，從而引發Ca2+超載、NO生成增多等級聯式毒性反應，最終導致神經細胞死亡[5～7]。MK-801是特異性最強、效能最高的非競爭性NMDA受體拮抗劑，主要作用于NMDA受體之苯環己派啶位點，阻斷與之耦聯的Ca2+通道，抑制Ca2+內流，從而減輕NMDA受體激動所引發的神經損傷，有研究表明[8]，MK801可能通過間接抑制脂質過氧化損傷作用,維持神經元細胞膜的完整性,減弱促凋亡相關蛋白表達。從而對缺血再灌注后的腦組織具有一定的保護意義。從而在治療腦損傷、缺血性腦血管疾病及抗驚厥等方面發揮重要作用[9]。

實驗性腦缺血的行為學評價方法可分為神經學檢查、感覺運動功能的評價和認知功能的評價。感覺運動功能的評價多用于實驗性腦缺血后運動功能恢復的遠期過程，此評價能較準確地反映動物不同程度腦缺血后的運動和感覺功能損傷，是較神經學檢查更敏感且定位相對準確的功能障礙評價方法。本研究顯示，藥物組第3、7天神經功能評分與模型組比較無差異，制模14 d神經功能評分低于模型組，提示MK-801可改善腦缺血大鼠的神經功能，具有神經保護作用，但需要一定的時間。

NGF在中樞及周圍神經系統有廣泛分布，其與受體p75NTR和TrkA結合后，能對神經元的生存、生長、增殖、分化、遷移及突觸的形成和連接起促進作用[10～12]。有研究[13]表明，成年哺乳動物因腦缺血造成的神經功能損傷產生代償性和修復作用，與缺血、缺氧導致中樞神經系統的內環境發生改變，誘導各種NGF的表達發生變化有關。本研究顯示，對照組NGF表達在制模后幾天無明顯差異，模型組從制模后第3天開始表達升高，第7天達到高峰，接近對照組的水平，到第14天表達下降。這一結果也證實腦缺血后可引起內源性NGF表達增加，但此過程只使內源性NGF短暫表達增加，不能全面且持久地保護受損神經元。本研究還發現，藥物組不同時間點NGF OD值均高于模型組和對照組。說明MK-801能促使MCAO大鼠在腦缺血時的NGF產生量增加、產生時限延長，從而對受損傷神經元發揮更好的保護作用。

NES屬于一種胚胎性第Ⅵ類中間絲蛋白，主要分布在胚胎發生期的中樞神經系統，并在干細胞增殖旺盛階段出現大量表達，參與細胞骨架的構成。從成年大鼠中樞神經系統中分離出的NES陽性細胞在體外培養呈集落性生長，并分化出神經元和膠質細胞的前體細胞，從而說明NES陽性細胞具有干細胞特征。目前，NES作為中樞神經系統發育過程中NSCs的特異性標記物被廣泛應用于NSCs的鑒定[14,15]。研究認為，在腦缺血情況下，神經干細胞可以增殖并遷移到病灶區，進而產生定向分化[16,17]。于東強等[18]報道，雄性Wistar大鼠在局灶性腦缺血再灌注損傷后，缺血同側及對側海馬區NES陽性細胞數量增多，7 d達到高峰，表明神經干細胞參與了腦缺血再灌注損傷后神經的自我修復。本文結果顯示，藥物組和模型組不同時間點NES表達均高于對照組，藥物組不同時間點NES表達均高于模型組，可見腦缺血后機體內部的NES蛋白被激活，經MK-801的作用表達得更為明顯。這表明MK-801可增強NES陽性細胞的表達，刺激內源性NSCs激活，進而增殖、分化及定向遷移，并分化出神經元和膠質細胞的前體細胞，達到修復和重塑受損神經的作用。但此過程具體機制目前還不十分明確，本研究認為這與MK-801抑制興奮性氨基酸毒性、調節微環境(生長因子、細胞因子)有關。

總之，MK-801可改善MCAO大鼠神經功能，其機制可能是通過增加MCAO大鼠大腦皮質內NGF、NES水平來實現。