FGF4在乳腺癌組織中的表達變化及對乳腺癌細胞株增殖、遷移能力的調控作用

曲杰，魏依蘭，呂喜英，李青山

(承德醫學院附屬醫院，河北承德 067000)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，已位居婦女惡性腫瘤死因的首位，全世界每年約有120萬婦女患上乳腺癌[1]。我國乳腺癌的發病率雖相對于西方歐美國家較低，但隨著近年人們生活水平的提高和生活方式的改變，其發病率呈上升趨勢。近年來，乳腺癌的診治取得了長足的進展，尤其是在外科治療方面的發展取得了較好的效果。與此同時，對乳腺癌生物學行為的認識也不斷深入，利用現代分子生物學技術對腫瘤的發生發展進行了進一步的闡述，針對乳腺癌的預后，尤其是已發生侵襲轉移的晚期患者預后較差，侵襲轉移機制亦已成為當今的研究熱點[2]。成纖維生長因子4(FGF4)是被FGF家族基因編碼的一種膜蛋白，它參與細胞生長、分化、侵襲以及胚胎發育、肢體發育、骨骼形成、組織修復、腫瘤復發等多種過程[3～5]。FGF4被認為是癌基因之一，其臨近的FGF3同樣在11號染色體，在很多腫瘤中被證實是擴增的基因。最近研究表明，FGF4高表達于食管鱗狀細胞癌。FGF4作為基因組組織器調控大量基因的表達，在肝癌中發揮巨大作用。然而，到目前為止有關FGF4在乳腺癌中的表達情況及相關作用尚不清楚。本研究觀察了FGF4在人乳腺癌組織和乳腺癌細胞株中的表達，并在此基礎上利用重組質粒和RNA干擾技術構建過表達FGF4、敲除FGF4的穩定細胞株，觀察其對乳腺癌細胞株增殖、遷移能力的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料 乳腺癌組織及對應癌旁正常乳腺組織購自西安奧美生物科技有限公司；人正常乳腺細胞株MCF-10A、低轉移乳腺癌細胞株T47D、高轉移乳腺癌細胞株MDA-MB-231均購于American Tissue Culture Collection(ATCC)，在本實驗室常規傳代；TRIzol、RNA酶抑制劑、RNA逆轉錄試劑盒及SYBR Green實時定量試劑盒均購自Invitrogen公司；PCR引物、shRNA由華大基因合成；Anti-FGF4抗體購自Proteintech Group；Western ECL發光試劑盒購自武漢三鷹公司；RPMI1640培養基和胎牛血清購自Gibco公司。限制性內切酶EcoRⅠ/XholⅠ、瓊脂糖凝膠電泳上樣緩沖液購自Thermo 公司；Taq DNA聚合酶、FastPful DNA聚合酶、DNA連接酶購自北京全式金生物技術有限公司；DNA切膠純化試劑盒、質粒小提試劑盒購自博邁德生物公司；RIPA購自Solibro公司。

1.2 乳腺癌、癌旁組織FGF4 mRNA檢測 采用實時定量PCR法。將40例份乳腺癌組織及40例份正常癌旁乳腺組織搗碎、碾碎，分別抽提1 μg總mRNA逆轉為cDNA。以SYBR Green為染料，實時定量PCR檢測樣品FGF4基因在mRNA表達的相對水平。設計并合成引物，以GAPDH作為內基因。FGF4上游引物5′-GAGCAGCAAGGGCAAGCTCTA-3′，下游引物5′-ACCTTCATGGTGGGCGACA-3′；GAPDH上游引物5′-CATCACCATCTTCCAG GAGCG-3′，下游引物5′-TGACCTTGCCC ACAGCCTTG-3′。以95 ℃、10 min，95 ℃、20 s，55 ℃、20 s，72 ℃、20 s為本實驗反應條件，共重復40循環，最終以72 ℃、5 min充分延伸。PCR結束采用溶解曲線確定產物特異性。由PCR反應曲線得到閾值循環數(Ct值)，FGF4 mRNA相對表達量用2-ΔΔCt法獲取。

1.3 MCF-10A、T47D、MDA-MB-231細胞FGF4 mRNA和蛋白檢測 ①細胞培養：MCF-10A細胞采用含10%馬血清的DMEM培養液進行培養；T47D細胞采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液進行培養；MDA-MB-231細胞含10%胎牛血清的DMEM培養液進行培養。培養條件均為37 ℃、飽和濕度、5% CO2，取對數生長期細胞備用。②FGF4 mRNA檢測：采用RT-PCR法。收集MCF-10A、T47D、MDA-MB-231細胞，分別抽提總的mRNA，并分別進行逆轉錄得到cDNA，以Taq酶為催化劑，PCR檢測FGF4基因在mRNA表達的相對水平。所用引物同“1.2”，以95 ℃、10 min，95 ℃、20 s，55 ℃、20 s，72 ℃、20 s為反應條件，共重復32個循環，最后以72 ℃、5 min充分延伸。PCR結束加6×loading buffer震蕩混勻，取等量擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統拍照，觀察比較結果，檢測灰度值。實驗結果均為3次獨立重復實驗結果。③FGF4蛋白檢測：采用Western blotting法。分別取約106個對數生長期的MCF-10A、T47D、MDA-MB-231細胞，提取各類細胞的總蛋白(加入300 μL RIPA，冰上裂解30 min后，移至1.5 mL的EP管中，以13 000 r/min在4 ℃條件下離心30 min，取上清液)，加5×loading buffer[250 mmol/L的Tris-HCl(pH6.8)、10%SDS、0.5%BPB、50%甘油，5%β-巰基乙醇]煮沸10 min，置于-20 ℃保存。BCA法定量。進行SDS-PAGE電泳分離并轉至PVDF膜，用新鮮配制的10%脫脂奶粉/TBST搖床上封閉1 h，加入FGF4鼠單克隆抗體(Santa Cruz，1∶1 000)及抗β-actin抗體(1∶20 000)，4 ℃反應過夜。TBST液洗滌3次，每次15 min，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，然后用TBST液進行3次洗滌，15 min每次，最后用化學發光法檢測，X光片顯影記錄相應結果，以用灰度值表示。

1.4 過表達FGF4的T47D穩定細胞株T47D-FGF4-oe及只轉染pCDNA3.1的細胞株T47D-NC中FGF4蛋白檢測和細胞增殖、遷移觀察 ①構建過表達FGF4的T47D穩定細胞株：參照文獻[6]，設計針對FGF4 mRNA全長的引物，上游引物5′-GGGAATTCGCCGCCATGTCGGGGCCCGGGACGGCCGCGGTA-GCGC-3′，下游引物5′-CCCTCGAGGGAGGGTCA-CAGCCTGGGGAGGAAGTGGGTGACCTTC-3。用Fa-

stPful DNA聚合酶擴增出目的基因，對表達載體pCDNA3.1和FGF4基因片段分別進行EcoRⅠ和XholⅠ雙酶切，酶連，轉化，鑒定獲得pCDNA3.1-FGF4重組質粒。因為Neo抗性基因存在于pCDNA3.1上，所以可利用G418(700 μg/mL)篩選FGF4過表達的穩定細胞株和pCDNA3.1空載細胞株，10 d后即可得到表達FGF4的穩定細胞株T47D-FGF4-oe和只轉染pCDNA3.1細胞株T47D-NC(作為陰性對照組)。②細胞增殖能力觀察：采用MTT實驗。分別抽取100 μL的T47D-NC、T47D-FGF4-oe細胞，接種于96孔板中，并于每孔中加入完全培養基；每種細胞鋪3個復孔。在培養各類細胞0、24、36、72 h分別加10 μL/孔的MTT溶液(5 mg/mL用PBS配制，pH7.4)，繼續4 h后停止培養，吸棄孔內上清液。每孔加DMSO 150 μL，避光搖床振蕩15 min，讓結晶物充分融解。在酶聯免疫檢測儀上取490 nm波長處測定各孔的OD值，記錄結果，橫坐標是時間，縱坐標是OD值，繪制細胞生長曲線。③遷移能力觀察：采用細胞劃痕實驗。在6孔板上分別接種T47D-NC、T47D-FGF4-oe細胞，待細胞貼壁長滿后，劃痕，用PBS沖洗2～3遍，換培養基為無血清培養基，并在0、24 h時分別拍照記錄，觀察劃痕愈合的情況。

1.5 敲除FGF4的細胞株MDA-MB-231-FGF4-si及只轉染pCDNA3.1細胞株MDA-MB-231NC中FGF4蛋白檢測和細胞增殖、遷移觀察 ①敲除FGF4構建穩定表達FGF4-shRNA的細胞株：參照文獻[6]，采集MDA-MB-231，構造針對FGF4的siRNA序列，根據已發表文獻有較好干擾效果的siRNA序列[7]：5′-CGAUGAGUGCACGUUCAAGdTdT-3′，3′-dTdTGCUA-CUCACGUGCAAGUUC-5′，將其克隆到pGFP-V-RS載體上，用Puromincin(2 μg/mL)篩選，過程同“1.4”獲得穩定表達FGF4-shRNA的細胞株，即MDA-MB-231-FGF4-si，只轉染pCDNA3.1的細胞株MDA-MB-231NC(作為對照組)。②增殖能力觀察：采用MTT實驗。分別抽取100 μL的MDA-MB-231-NC、MDA-MB-231-FGF4-si細胞，接種于96孔板中，并于每孔中加入完全培養基；每種細胞鋪3個復孔。在培養各類細胞0、24、36、72 h時分別加10 μL/孔的MTT溶液(5 mg/mL用PBS配制，pH7.4)，繼續4 h后停止培養，吸棄孔內上清液。每孔加DMSO 150 μL，避光搖床振蕩15 min，讓結晶物充分融解。在酶聯免疫檢測儀上取490 nm波長處測定各孔的OD值，記錄結果，橫坐標是時間，縱坐標是OD值，繪制細胞生長曲線。③細胞遷移能力觀察：采用細胞劃痕實驗。在6孔板上分別接種MDA-MB-231-NC、MDA-MB-231-FGF4-si細胞，待細胞貼壁長滿后，劃痕，用PBS沖洗2～3遍，換培養基為無血清培養基，并在0、24 h時分別拍照記錄，觀察劃痕愈合的情況。

2 結果

2.1 乳腺癌、癌旁組織中FGF4 mRNA比較 乳腺癌、癌旁組織中FGF4 mRNA相對表達量分別為1.68±0.13、0.32±0.12，兩者比較，P<0.05。

2.2 MCF-10A、T47D、MDA-MB-231細胞FGF4 mRNA和蛋白灰度值比較 MCF-10A、T47D、MDA-MB-231細胞FGF4 mRNA灰度值分別為0.27±0.11、1.26±0.13、1.87±0.15，MCF-10A、T47D細胞分別與MDA-MB-231細胞比較，P均<0.05。MCF-10A、T47D、MDA-MB-231細胞FGF4蛋白灰度值分別為0.23±0.06、1.03±0.10、1.72±0.17，兩兩比較，P均<0.05。

2.3 T47D-FGF4-oe細胞及T47D-NC細胞的FGF4蛋白表達和細胞增殖、遷移能力比較 T47D-FGF4-oe、T47D-NC細胞FGF4蛋白灰度值分別為1.27±0.10、0.55±0.08，兩者比較，P<0.05。T47D-FGF4-oe、T47D-NC細胞增殖能力比較見表1，由表1可知，T47D-FGF4-oe細胞的增殖速度高于T47D-NC細胞。T47D-FGF4-oe、T47D-NC細胞遷移能力比較見圖1，由圖1可知，T47D-FGF4-oe細胞的劃痕距離小于T47D-NC細胞。

2.4 MDA-MB-231-FGF4-si細胞及MDA-MB-231-NC細胞的FGF4蛋白表達和細胞增殖、遷移能力比較 MDA-MB-231-FGF4-si、MDA-MB-231-NC細胞FGF4蛋白灰度值分別為0.61±0.07、1.89±0.14，兩者比較，P<0.05。MDA-MB-231-FGF4-si、MDA-MB-231-NC細胞增殖能力比較見表1，由表1可知，MDA-MB-231-FGF4-si細胞的增殖速度低于MDA-MB-231-NC細胞。MDA-MB-231-FGF4-si、MDA-MB-231-NC細胞遷移能力比較見圖2，由圖2可知，MDA-MB-231-FGF4-si細胞的劃痕距離大于MDA-MB-231-NC細胞。

表1 細胞增殖能力比較

圖1 過表達FGF4對T47D細胞遷移能力的影響

圖2 干擾FGF4對MDA-MB-231細胞遷移能力的影響

3 討論

乳腺癌是源于乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤，女性占99%，是威脅女性生命健康最為頻發的惡性腫瘤之一。乳腺癌發病率呈攀升趨勢，并向年輕化發展(<35歲)，影響人類發展，外科手術治療仍是早、中期乳腺癌患者的首選治療方式[8,9]。而乳腺癌細胞的早期轉移和復發是引起乳腺癌患者死亡的主要原因，也是乳腺癌治療中的最大難題之一。乳腺癌轉移是惡性腫瘤最基本的生物特征，是一個極其復雜、涉及腫瘤與宿主之間相互作用的多步驟的過程，受許多相關基因(CXCR4、CYP1A1、COMT等)的調控[10～12]，所以研究腫瘤轉移發生過程中的潛在分子機制具有重要意義[13]。

成纖維細胞生長因子(FGFs)是一類由FGF基因家族編碼的結構相關的蛋白質，到目前為止FGF家族已發現至少有23種。FGFs和存在于細胞表面的FGFs受體(FGFRs)結合，將信號傳遞到胞內，進而激活RAS-MAPK、PI3K-AKT、PKC等信號通路，來調控細胞復制、存活、遷移和分化過程。并介導無數的生物學和病理生理學過程，包括血管生成、傷口愈合、胚胎發育、代謝調節和腫瘤增殖、轉移等[14～19]。近年研究者發現了FGF家族基因編碼的一種膜蛋白FGF4，它涉及到腫瘤細胞分裂、生長、侵襲及胚胎發育、組織修復、腫瘤復發等[20～22]。

Wang等[23]首次發現人乳腺癌細胞系表達FGF4，轉染FGF4的HBL100能使裸鼠成瘤，但沒有深入研究。后來有學者發現，FGF4作為癌基因在食管鱗狀細胞癌、卵巢癌[24]、肝細胞癌[25]、肺腺癌[26]等中高表達。為了檢測FGF4在乳腺癌中的表達情況，本文通過實驗發現乳腺癌組織中FGF4 mRNA表達高于癌旁組織；T47D、MDA-MB-231細胞中FGF4蛋白和mRNA表達水平也高于MCF-10A，MDA-MB-231表達高于T47D。研究結果證明，FGF4與乳腺癌的增殖和轉移密切相關。為進一步檢測FGF4對乳腺癌細胞增殖和轉移的影響，我們利用構建過表達FGF4的T47D穩定細胞株和敲除FGF4的MDA-MB-231穩定細胞株進行MTT和劃痕實驗，實驗證實FGF4對癌細胞的生長及轉移有顯著正向調控作用。

總之，FGF4在乳腺癌中呈高表達，并有促進乳腺癌細胞株增殖、轉移能力的作用。但具體調控的基因和分子機制尚不清楚，有待于進一步研究。本文了解并研究FGF4與乳腺癌侵襲轉移的關系，將有望以其作為治療靶點及生物標志物，控制乳腺癌轉移，提高患者生存質量，具有良好的臨床應用前景。