益生菌聯(lián)合制劑預(yù)先灌胃對(duì)急性感染性腦損傷小鼠抑郁樣行為的改善作用

徐娜娜，李聰，潘智華，顧兵2,

(1徐州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)形態(tài)實(shí)驗(yàn)學(xué)分中心，江蘇徐州 221004；2徐州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院；3徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

急性感染性腦損傷為一種嚴(yán)重危害兒童和成人健康的感染性疾病，是由各種化膿菌引起的以腦膜炎癥為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，發(fā)病率與年齡有關(guān)，嬰幼兒多見(jiàn)[1]；革蘭陰性菌是其常見(jiàn)的病原體，脂多糖(LPS)是革蘭陰性桿菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素，進(jìn)入機(jī)體后可以產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫炎癥反應(yīng)，為此病的主要致病因子。腹腔或側(cè)腦室注射LPS，可以誘導(dǎo)動(dòng)物出現(xiàn)厭食、疲勞、快感缺乏、體質(zhì)量減輕和睡眠障礙等一系列抑郁樣行為[2]。目前，LPS誘導(dǎo)小鼠抑郁的動(dòng)物模型已成為研究抑郁癥與免疫炎癥關(guān)系及評(píng)價(jià)抗抑郁藥物的重要?jiǎng)游锬Ｐ蚚3]。隨著抗生素和糖皮質(zhì)激素的廣泛使用，急性感染性腦損傷的發(fā)病率已明顯減少，但仍有較高的病死率和致殘率。抑郁癥是一常見(jiàn)的精神疾病，嚴(yán)重危害人類健康，隨著生活節(jié)奏的不斷加快和社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)的日益加劇，世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)到2020年抑郁癥將成為全球殘疾負(fù)擔(dān)的第二大原因[4]。近年越來(lái)越多的研究[5]發(fā)現(xiàn)，感染性腦損傷的炎癥反應(yīng)與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。益生菌是一類主要定植于人體腸道、生殖系統(tǒng)內(nèi)，對(duì)宿主機(jī)體健康有益的低致病性或無(wú)致病性微生物，可以是單一菌株制成，也可以是多種菌的復(fù)合制劑[6]。近年來(lái)以多種益生菌為基礎(chǔ)所制備的各種聯(lián)合制劑受到越來(lái)越多的關(guān)注。研究[7]發(fā)現(xiàn)，多種益生菌的聯(lián)合制劑具有很好抗炎、抗氧化、清除自由基等生物活性。此外，益生菌聯(lián)合制劑還可以調(diào)節(jié)一系列與精神疾病有關(guān)的行為，包括抑郁樣行為[8]。那么益生菌聯(lián)合制劑對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠抑郁行為是否有保護(hù)作用，目前研究較少，且效應(yīng)機(jī)制亦不十分明確。本研究觀察了益生菌聯(lián)合制劑預(yù)先灌胃對(duì)急性感染性腦損傷小鼠抑郁樣行為的改善作用，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 益生菌聯(lián)合制劑、試劑及行為學(xué)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng) 益生菌聯(lián)合制劑(包括雙歧桿菌、乳酸菌、乳糖和酵母等成分的多種益生菌的混合制劑)，已申請(qǐng)國(guó)家專利，專利號(hào)為ZL2015104679586，購(gòu)自南京伯恩立施生物科技有限公司。IL-6、TNF-α單克隆抗體及LPS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)為ZH-ZFT型自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)(淮北正華公司)，活動(dòng)箱大小為500 mm×500 mm×300 mm，采用Anymaze system4.72軟件(Stoelting公司)記錄分析。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)雄性健康ICR小鼠36只，3周齡，體質(zhì)量8～11 g，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。36只小鼠隨機(jī)分為益生菌組、脂多糖組、對(duì)照組，每組12只。

1.3 益生菌聯(lián)合制劑應(yīng)用方法及急性感染性腦損傷模型制備 各組小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后，益生菌組預(yù)先灌胃100 mg/(kg·d)的益生菌聯(lián)合制劑2周，末次給藥1 h后，益生菌組和脂多糖組均腹腔注射1 mg/kg的LPS制備急性感染性腦損傷模型(小鼠出現(xiàn)立毛、上瞼下垂或嗜睡等表現(xiàn)說(shuō)明造模成功)；對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水。

1.4 小鼠抑郁樣行為評(píng)價(jià) 制模6 h后，應(yīng)用ZH-ZFT型自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)記錄與分析各組小鼠的抑郁樣行為。用Anymaze system軟件將活動(dòng)箱空間平均劃分為9個(gè)區(qū)域。先將小鼠置于明亮的曠場(chǎng)活動(dòng)箱中適應(yīng)2 min取出，再?gòu)幕顒?dòng)箱的中央位置放入，記錄其5 min的行為學(xué)指標(biāo)，包括活動(dòng)時(shí)間、總路程(總活動(dòng)度)、軌跡、區(qū)域分布，對(duì)運(yùn)動(dòng)總路程和穿格次數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。再將小鼠置于黑暗的閉場(chǎng)活動(dòng)箱中，同樣方法記錄相應(yīng)行為學(xué)指標(biāo)。

1.5 海馬組織IL-6、核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)表達(dá)檢測(cè) 采用蛋白質(zhì)印跡法。各組小鼠抑郁樣行為評(píng)價(jià)完成后，每組取6只立即處死，取腦組織，在冰上分離出大腦皮質(zhì)，存放于凍存管，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩⒛X組織中加入裂解液，勻漿后，以12 000 r/min在4 ℃條件下離心15 min，所得上清即為胞質(zhì)蛋白提取液。胞質(zhì)蛋白用4×蛋白處理液配制成等濃度的蛋白樣品。取等量蛋白樣品10%SDS-PAGE分離后，以濕轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)至NC膜上，脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入抗體孵育后洗膜，顯色后條帶掃描、分析及打印。目的蛋白表達(dá)量以免疫印跡中各目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參β-actin的比值來(lái)表示。

1.6 海馬CA3區(qū)神經(jīng)元計(jì)數(shù) 采用焦油紫染色法。取各組剩余6只小鼠，動(dòng)物麻醉后多聚甲醛灌注，快速取腦后固定24 h。石蠟包埋，切片機(jī)切片(5 μm)。采用焦油紫染色，37 ℃下染色15 min，70%酒精分色，脫蠟后中性樹(shù)脂封片，觀察并計(jì)數(shù)海馬CA3區(qū)1 mm2區(qū)域中存活的神經(jīng)元。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠抑郁樣行為比較 ①活動(dòng)軌跡：對(duì)照組小鼠曠場(chǎng)和暗場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中活動(dòng)軌跡復(fù)雜，多處于四角和四邊區(qū)中，中央?yún)^(qū)相對(duì)較少；脂多糖組小鼠活動(dòng)軌跡簡(jiǎn)單，基本沒(méi)有進(jìn)入中央?yún)^(qū)；益生菌組小鼠活動(dòng)軌跡的復(fù)雜程度居于前兩組之間，分布特點(diǎn)依然是周邊區(qū)多，中央?yún)^(qū)少。②活動(dòng)距離、穿格次數(shù)：各組小鼠制模6 h后曠場(chǎng)、閉場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中自主活動(dòng)路程和穿格次數(shù)比較見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠制模6 h后自主活動(dòng)路程和穿格次數(shù)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與脂多糖組比較，△P<0.05。

2.2 各組小鼠大腦海馬組織IL-6、NF-κB相對(duì)表達(dá)量比較 益生菌組IL-6、NF-κB相對(duì)表達(dá)量分別為0.61±0.04、0.41±0.03，脂多糖組分別為1.03±0.06、0.68±0.07，對(duì)照組分別為0.04±0.08、0.38±0.01，益生菌組、對(duì)照組分別與脂多糖組比較，P均<0.05。

2.3 各組小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元存活數(shù)比較 對(duì)照組小鼠CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)目多，排列整齊、緊密，細(xì)胞形態(tài)飽滿，結(jié)構(gòu)完整，邊緣清晰；而脂多糖組小鼠CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)目相對(duì)較少，排列紊亂、疏松，細(xì)胞形態(tài)差，結(jié)構(gòu)不完整，基質(zhì)疏松及空泡形成，細(xì)胞存活數(shù)明顯低于對(duì)照組；與脂多糖組比較，益生菌組CA3區(qū)神經(jīng)元存活數(shù)顯著提高。益生菌組、脂多糖組、對(duì)照組神經(jīng)元存活數(shù)分別為(132±5.97)、(51±4.31)、(146±6.78)個(gè)，益生菌組、對(duì)照組分別與脂多糖組比較，P均<0.05。

3 討論

急性感染性腦損傷是由各種化膿菌引起的以腦膜炎癥為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，常會(huì)導(dǎo)致患者認(rèn)知障礙和抑郁行為等，此病治療困難，嚴(yán)重影響患者身心健康[9]。目前，臨床上主要針對(duì)感染性腦損傷導(dǎo)致的后遺癥進(jìn)行治療，主要包括高壓氧、康復(fù)訓(xùn)練及營(yíng)養(yǎng)腦神經(jīng)等，但尚無(wú)特效藥提前干預(yù)[10]。因此，積極探索減輕腦損傷的藥物具有重要意義。關(guān)于感染性腦病導(dǎo)致抑郁樣行為的病因和發(fā)病機(jī)制至今沒(méi)有完全闡明。細(xì)胞因子是免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能，根據(jù)其在炎癥反應(yīng)中的作用不同可分為促炎癥細(xì)胞因子和抗炎癥細(xì)胞因子[11]。自Maes[12]提出抑郁癥的細(xì)胞因子假說(shuō)后，大量研究論證了抑郁行為常伴有免疫激活，表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞因子分泌增多；且免疫激活也會(huì)引起個(gè)體情緒和行為的改變。因此，細(xì)胞因子可被看作是抑郁癥的生物標(biāo)記物[13]。

益生菌是一組寄生于人體腸道的正常菌群，通過(guò)生物拮抗改善宿主腸道菌群生態(tài)平衡、刺激腸黏膜內(nèi)皮細(xì)胞分泌的分泌型免疫球蛋白而發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用，從而達(dá)到提高寄生宿主健康狀態(tài)的微生物[14]。臨床常用的益生菌有乳酸桿菌、糞鏈球菌、枯草桿菌、嬰兒雙歧桿菌、酪酸梭菌、酵母菌、腸球菌和蠟樣芽孢桿菌等菌株[15]。雖然不同種屬的菌株效果并不完全一致，但大多數(shù)的研究表明益生菌對(duì)人類和動(dòng)物有廣泛的影響，且多種益生菌聯(lián)合使用效果更為突出。有研究[16]發(fā)現(xiàn)，含有瑞士乳桿菌和長(zhǎng)雙歧桿菌的益生菌聯(lián)合制劑降低了動(dòng)物和人類的焦慮性行為，同時(shí)也逆轉(zhuǎn)了大鼠心肌梗死后的抑郁樣行為[17]。此外，嬰兒雙歧桿菌可以減輕外周血中促炎細(xì)胞因子和色氨酸濃度，從而發(fā)揮抗抑郁樣行為作用[18]。研究[19]發(fā)現(xiàn)，添加益生菌的早期腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)可在一定程度上減少重型顱腦損傷所致炎癥反應(yīng)，降低患者血清中NF-κB、IL-6水平。

曠場(chǎng)、閉場(chǎng)實(shí)驗(yàn)是反映大鼠在新環(huán)境中探究行為及情緒的方法，可用來(lái)測(cè)試動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮或抑郁狀態(tài)[20]。穿格數(shù)及直立次數(shù)表示小鼠的探究行為，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，脂多糖組小鼠空間認(rèn)知能力降低，對(duì)新環(huán)境的適應(yīng)能力減弱，緊張程度增高，小鼠在陌生環(huán)境中的自主活動(dòng)和探究行為減少，表現(xiàn)為抑郁樣。在本實(shí)驗(yàn)中，腹腔注射LPS可以引起小鼠抑郁樣行為，表現(xiàn)為小鼠曠場(chǎng)自助活動(dòng)減少，穿格次數(shù)較少，而益生菌可顯著改善小鼠曠場(chǎng)的自主活動(dòng)。閉場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，雖然自主活動(dòng)距離沒(méi)有顯著差異，但脂多糖組穿格次數(shù)明顯減少，說(shuō)明注射LPS后，小鼠有抑郁樣溜邊的表現(xiàn)，探究行為明顯減少，而益生菌對(duì)這種現(xiàn)象有明顯的改善作用。

LPS是革蘭陰性桿菌產(chǎn)生的一種內(nèi)毒素，進(jìn)入機(jī)體后可以通過(guò)激活NF-κB，誘導(dǎo)產(chǎn)生各種炎癥細(xì)胞因子，IL-6是該過(guò)程中產(chǎn)生的一種關(guān)鍵促炎癥細(xì)胞因子[21,22]。現(xiàn)有研究表明，IL-6在抑郁癥的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。臨床抑郁患者常表現(xiàn)出IL-6升高，常用的抗抑郁藥氟西汀可明顯降低小鼠腦組織與血清IL-6的表達(dá)[23]。NF-κB是細(xì)胞中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其在機(jī)體中通常以p50-p65二聚體形式與抑制性蛋白IκB結(jié)合，呈非活化狀態(tài)[24]。當(dāng)機(jī)體受到外界刺激(如LPS)后，NF-κB與抑制蛋白解離，變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，活化的NF-κB可促使IL-6、TNF-α等炎癥因子分泌增加，引起免疫炎癥反應(yīng),進(jìn)而可能導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)生[25]。本研究顯示，小鼠腹腔注射LPS后，大腦海馬組織中IL-6和NF-κB表達(dá)較對(duì)照組升高；而益生菌聯(lián)合制劑可顯著降低LPS引起的小鼠海馬組織IL-6和NF-κB表達(dá)升高。本研究還顯示，益生菌能夠提高小鼠海馬神經(jīng)元的存活率，證明益生菌可減輕LPS導(dǎo)致的小鼠抑郁樣癥狀與保護(hù)海馬神經(jīng)元損傷有關(guān)。

總之，益生菌聯(lián)合制劑可改善急性感染性腦損傷小鼠的抑郁樣行為，機(jī)制可能與其可降低IL-6、NF-κB表達(dá)及抑制海馬神經(jīng)元損傷有關(guān)。