lncRNA-AB073614在U251細胞中的表達及對細胞增殖、遷移、侵襲能力的影響

蘇龍，林濤，車海江，郭世文

(1西安交通大學第一附屬醫院，西安 710061；2西電集團醫院)

腦膠質瘤是最常見的成人原發性腦腫瘤，約占顱內惡性腫瘤的80%[1]。腦膠質瘤根據病理組織惡性程度分為WHO Ⅰ～Ⅳ級，通常認為 Ⅰ～Ⅱ級是低級別腦膠質瘤， Ⅲ～Ⅳ級是高級別腦膠質瘤[2,3]。盡管臨床上腦膠質瘤的治療已取得一些進展，包括手術切除以及術后放化療等，但絕大部分患者預后仍較差，尤其是膠質母細胞瘤患者，術后生存期為9～12個月，5年生存率低于10%[4～6]。而目前相關研究顯示，腦膠質瘤發生發展的基本機制仍不清楚。因此，探索腦膠質瘤發病的分子機制，尋找更有效的治療方法迫在眉睫。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度超過200個氨基酸的RNA，其不具備蛋白質編碼能力，但可通過干擾mRNA剪切、降解和翻譯等過程發揮作用[7,8]。現有研究[9,10]表明，lncRNA在腫瘤與正常組織中存在差異表達，且與多種腫瘤疾病的發生和進展有關，參與腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡等過程。lncRNA-AB073614是新發現的一種lncRNA，其在腦膠質瘤組織中表達異常增加，且是影響腦膠質瘤患者預后的獨立危險因素，但其對腦膠質瘤發生發展的作用機制仍不清楚[11,12]。本研究觀察了腦膠質瘤細胞中lncRNA-AB073614表達變化及小分子干擾RNA片段(si-RNA)轉染對其細胞增殖、遷移、侵襲能力的影響，旨在為腦膠質瘤的早期診斷和治療尋找新的靶點提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、儀器及試劑 腦膠質瘤細胞U251、正常星形膠質細胞NHA均購自中科院上海生命研究院；10%胎牛血清(FBS)、Opti-MEM、DMSO試劑、MTT試劑、DMEM細胞培養液均購自美國Gbico公司；胰酶消化液購自美國Hyclone公司；TRIzol、Lipofectamine2000轉染試劑、AB073614引物均購自Invitrogen公司；細胞培養耗材購自BD公司；si-RNA干擾序列由Life公司提供；Transwell小室購自美國Corning公司；Matrigel購自BD公司；7300型熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2 U251細胞、NHA細胞AB073614檢測 U251細胞及NHA細胞培養在含10%胎牛血清、1%青霉素的DMEM培養基中，培養溫度是37 ℃，CO2濃度為5%。TRIzol法提取U251、NHA細胞的總RNA，用分光光度計定量，按逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cRNA，生成條件為37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃、10 min。cDNA稀釋成10倍后放于-20 ℃保存，待后續使用。選擇GAPDH作為內參，結果以2-ΔΔCt表示，所有實驗操作至少重復3次。用7300型熒光定量PCR儀進行擴增，AB073614引物正義鏈：5′-ATTTCTGCTCCTGGGTCTTAC-3′，反義鏈：5′-AGTGGCTTGTCTGTTAGAGTC-3′；內參GAPDH正義鏈：5′-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3′，反義鏈5′- CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。

1.3 U251細胞增殖、遷移、侵襲能力檢測 ①細胞轉染：轉染前1 d，將生長良好的U251細胞經胰酶消化離心后，取50×103個/瓶，接種于6孔板含10%FBS培養液中培養過夜，待6孔板中細胞匯合度在70%～80%時進行Opti-MEM、Lipofectamine2000介導的轉染，轉染6 h后更換培養基，繼續48 h。以此建立細胞模型，待后續實驗。②細胞增殖能力檢測：采用MTT實驗。將轉染si-AB073614后的U251細胞、未轉染的U251細胞分別接種于96孔板中培養，培養時間為0、24、48、72、96 h，培養后加入MTT溶液20 μL(5 mg/mL)，再次放入培養箱中培養2 h，并在每個孔中加入DMSO 150 μL，輕輕震蕩混勻后，用酶聯免疫檢測儀測定490 nm處的吸光度值，根據測量結果繪制細胞生長曲線，比較細胞的生長情況。③細胞遷移能力檢測：采用細胞劃痕實驗。將si-AB073614處理U251細胞、未轉染的U251細胞傳代重懸后，分別用細胞計數儀測量細胞的濃度，計算出目前細胞總數目，將相同數目的細胞接種到35 mm的培養皿中，在其底部做好標記，可清楚識別分割區域，細胞匯合度在50%～60%，每個培養皿中培養液在2 mL即可，體積不足用培養液配平，細胞接種后在4 ℃環境下培養24 h，當細胞密度達到100%時，用200 μL槍頭進行劃線，使觀察區域達到4～6個，劃線后倒掉培養液，用PBS洗2次，洗掉懸浮的死細胞，重新加入完全培養液中培養細胞，每隔6～12 h觀察傷口愈合情況，并拍攝相應的普光和熒光照片。36～48 h后結束觀察。所有實驗分別獨立重復3次，取平均值。比較細胞遷移能力。④細胞侵襲能力檢測：采用Transwell實驗。實驗前將基質膠置于冰盒中，保持液體狀態，在Transwell小室里分別加入200 μL的DMEM并放入到溫箱中進行水化1 h。鋪基質膠實驗中，水化后吸去200 μL的DMEM，在小室中加入基質膠與DMEM的混合液60 μL，放入溫箱中培養30 min使其凝固，待基底膜干燥后，滴入單細胞懸液培養24 h，在顯微鏡下觀察細胞穿透基底膜的數量，隨機計數5個視野，取其平均值。

2 結果

2.1 U251、NHA細胞AB073614表達比較 U251、NHA細胞中AB073614表達水平分別為3.57±0.28、1.00±0.17，兩者比較，P<0.05。

2.2 U251細胞增殖、侵襲、遷移能力比較 MTT實驗顯示，si-AB073614處理的U251細胞存活率顯著低于未轉染的(P<0.05)，提示敲除U251細胞內AB073614的表達后，可明顯抑制腦膠質瘤細胞增殖能力(見圖1A)。細胞劃痕實驗顯示，si-AB073614處理的U251細胞遷移能力明顯低于未轉染的(P<0.05)，詳細見圖1B。Transwell實驗顯示，si-AB073614處理的U251細胞穿膜細胞數明顯低于未轉染的(P<0.05)，詳見圖1C。上述結果說明，抑制AB073614表達，可明顯降低腦膠質瘤細胞的增殖、遷移、侵襲能力。

圖1 si-AB073614轉染對U251細胞增殖、遷移、侵襲能力的影響

3 討論

腦膠質瘤是常見的原發性顱內惡性腫瘤，在中國的發病率呈逐年上升趨勢，同時因其惡性程度高、預后差，越來越受到人們的關注，急需新的治療方法及腫瘤標記靶點用于腦膠質瘤的診斷和治療[13,14]。以往對于腦膠質瘤的研究主要集中在與其發生發展密切相關的細胞異常分化、細胞增殖失控、細胞外基質降解、基底膜破壞等方面[15]。近年研究表明，lncRNA可參與基因組的修飾、類似ceRNA作用參與對靶基因調控、結合特異性DNA或RNA對靶基因的表達進行轉錄激活和轉錄后調控。隨著對lncRNA在腫瘤發生發展中的研究越來越多，使其成為腫瘤研究的熱點[16,17]。文獻[18]報道，腦膠質瘤U87細胞可見lncRNA-ATB，并發現其可明顯抑制腦膠質瘤細胞增殖、侵襲和遷移過程，這說明lncRNA-ATB與腦膠質瘤的發生發展關系密切。另外學者對lncRNA-MEG3、CRNDE等在腦膠質瘤中的作用也進行了深入研究[19,20]，而反觀lncRNA-AB073614只是在其他惡性腫瘤組織中證實表達明顯高于癌旁正常組織，且在這些腫瘤的發生發展過程中發揮重要的調節作用，但對lncRNA-AB073614在腦膠質瘤領域的研究較少[21]。

lncRNA-AB073614是一種最新發現的lncRNA，以往研究主要集中在其與結直腸癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌等腫瘤的關系方面。Xue等[22]對lncRNA AB073614在結直腸癌中的作用研究結果顯示，在SW480和HCT116細胞中，lncRNA-AB073614敲除后顯著促進了E-cadherin和Occludin蛋白表達水平，并降低了N-cadherin和Vimentin的表達，進一步降低了細胞的遷移和侵襲能力，影響結直腸癌細胞的生長。Cheng等[23]發現，在HO-8910細胞和OVCAR3細胞中，敲低AB073614表達可顯著抑制細胞增殖和侵襲，導致細胞周期中G1期細胞停滯和凋亡增加，體內實驗還證實敲低AB073614可抑制OVCAR3細胞增殖，AB073614在卵巢癌發育中充當功能性癌基因的作用，對腫瘤的發生發展起促進作用。研究[24]認為，lncRNA-AB073614表達SOX7抑制胃癌的發生和進展，且lncRNA-AB073614表達與胃癌的腫瘤體積、TNM分期、血管神經浸潤等明顯相關，因此可以作為胃癌早期診斷的重要指標。Sun等[25]發現，lncRNA-AB073614在乳腺癌的擴散、浸潤發揮重要作用，通過表達SOX7和AXIN2發揮作用，兩者的表達均與乳腺癌腫瘤的體積、浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期等相關，影響乳腺癌癌細胞的增殖、遷移與侵襲。研究證實，AB073614在人腦膠質瘤組織中的表達明顯高于正常腦組織，且可作為預測腦膠質瘤患者預后的獨立危險因素，然而對于AB073614在腦膠質瘤中的具體作用機制作者并未提及。因此，我們的研究重點是在此基礎上，探討AB073614在體外腦膠質瘤細胞中的表達以及作用。本研究顯示，AB073614在神經膠質瘤細胞中呈高表達狀態。本研究還顯示，敲除AB073614的腦膠質瘤細胞較未轉染的腦膠質瘤細胞增殖、遷移、侵襲能力明顯減弱，提示敲除AB073614基因可能對腫瘤的進展具有抑制作用。

總之，U251細胞中AB073614表達升高，si-RNA轉染AB073614能明顯抑制其增殖、侵襲、遷移能力。