大鼠shRNA-TRPC4重組腺病毒載體的構建及其在EPCs中轉染效率的測定*

林慕之，劉興德,張 璐，劉姿麟，劉志琴,況春燕△

(1.貴州醫科大學附屬人民醫院/貴州省人民醫院心內科，貴陽 550002；2.貴州醫科大學附屬醫院心內科，貴陽 550004)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)、高血壓等疾病發病的共同環節是血管內皮的損傷和損傷后的不良修復，因此,防治此類疾病的關鍵是盡早促進損傷血管內皮的修復。1997年ASAHARA等[1]首次分離出的內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，其可分化為成熟的內皮細胞從而促進血管內皮的修復[2]。瞬時感受器電位(transient receptor potential,TRP)通道是陽離子通道的一個超家族，廣泛分布于多種細胞，并在功能調節中起重要作用[3]，主要充當鈣內流孔道促使胞外鈣內流[4]。瞬時感受器電位C離子通道(transient receptor potential canonical channel,TRPC)是一個重要亞家族[5]。研究表明TRPC在平滑肌細胞中對細胞增殖和收縮功能起重要作用[6-7]。TRPC亞家族包含7個成員，分別為TRPC1～7，其中TRPC4參與血管緊張性和滲透性的調節[8]，并可以調控血管再生[9]、內皮細胞增殖和凋亡[10]。EPCs作為內皮細胞的前體細胞，TRPC4是否參與其生物學功能的調節目前仍未闡明。為研究TRPC4對EPCs生物學功能的影響，本研究構建大鼠TRPC4的重組腺病毒干擾質粒并觀察其在EPCs中的轉染效率，現報道如下。

表1 DNA Oligo片段及陰性對照

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物和試劑 清潔級(170±20)g SD大鼠購于貴州醫科大學動物實驗中心；pDK-CMV-GFP-U6-shRNA載體、限制性內切酶AgeⅠ和 EcoRⅠ購于紐恩(上海)生物科技有限公司；HEK293細胞購于上海和元生物技術有限公司；大鼠組織淋巴細胞分離液購于天津灝洋生物生物制品科技有限公司；小抽試劑盒購于Promega公司；4 DNA ligase和內切酶購于NEB公司；Taq酶和dNTP DH5α感受態細胞、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自Takara公司；引物由上海英駿生物技術有限公司合成；華大基因進行陽性克隆測序。

1.1.2儀器 DNA電泳槽、穩壓電泳儀(北京六一儀器廠)；電熱恒溫水槽(上海一恒科學儀器有限公司)；凝膠成像儀(上海天能科技有限公司)；恒溫培養箱(上海精宏實驗設備有限公司)；恒溫搖床(太倉市實驗設備廠)；PCR儀(Applied Biosystems公司)；冷凍高速離心機(Thermo公司)；移液器(Eppendorf公司)。

1.2方法

1.2.1TRPC4腺病毒穿梭質粒構建 從GenBank中查詢大鼠TRPC4基因(NM_001083115)上下游序列設計并合成4對siRNA前體寡核苷酸片段，siTRPC4-1：GGT GGA ATC TAA TGG ACT TTG；siTRPC4-2：GCT TTG GAT GAG CTA CTT TGA；siTRPC4-3：GCA GCA TTC CTG GTC TCA ATG；siTRPC4-4：GGA GGA CTC AAG CAT AGA TTA。設陰性對照NC序列：TTC TCC GAA CGT GTC ACG T，合成DNA雙鏈Oligo片段，見表1。將得到的DNA oligo片段加水溶解至40 μmol/L。在退火體系中加入溶解好的正反義DNA oligo片段各18 μL，10×Buffer 4 μL，混勻后置于95 ℃水浴，10 min 后取出置于室溫，使之自然冷卻。取pDK-CMV-GFP-U6-shRNA載體經AgeⅠ和EcoRⅠ酶切使載體線性化。然后將雙鏈DNA連接入酶切載體后轉化入大腸桿菌DH5α感受態細胞，于恒溫培養箱中培養16 h。

1.2.2PCR陽性克隆鑒定及測序對比 挑取平板上長出的轉化子進行菌落PCR鑒定。正向引物：5′-CCT ATT TCC CAT GAT TCC TTC ATA-3′， 反向引物：5′-GTA ATA CGG TTA TCC ACG CG-3′。將菌落鑒定得到的陽性克隆進行測序驗證，通過Chromas測序軟件分析設計的4對穿梭質粒是否與設計的4對干擾靶點序列一致。

1.2.3腺病毒包裝 利用Admax系統，選取目的穿梭質粒shRNA-TRPC4(1)與腺病毒骨架質粒共轉染到HEK293細胞中獲得重組腺病毒。將HEK293細胞接種到6孔板中，控制細胞轉染時的密度為70%～80%。轉染前1 h去除原有細胞培養基，加入1.5 mL的Opti-MEM培養基。將待轉染的病毒載體質粒4 μg(骨架質?！么┧筚|粒=1∶1)溶于Opti-MEM培養基，總體積為250 μL，混勻。將8 μL和腺病毒包裝轉染試劑溶于Opti-MEM培養基，總體積為250 μL，混勻。將腺病毒包裝轉染試劑稀釋液滴加到質粒稀釋液中，邊加邊輕輕混勻，室溫靜置20 min，使DNA和轉染試劑充分結合形成穩定的轉染復合體。將配好的DNA-轉染試劑復合體加入到細胞培養板中。6 h后吸去培養基，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗1次，加入2 mL新鮮完全培養基培養。每72小時補液1次，約7～15 d病毒空斑出現，完全病變后，收集上清液。經包裝后的shRNA-TRPC4腺病毒質粒命名為Ad-shRNA-TRPC4。

1.2.4腺病毒擴增 將HEK293細胞鋪在10 cm培養皿中，待細胞長到90%以上匯合度，加入合適滴度的病毒1 000 μL，感染細胞，待5～6 d全部病變后，收取病毒，并反復凍融細胞3次，分裝。

1.2.5病毒滴度測定 選取狀態良好的HEK293細胞，接種至24孔板中，每孔種入5.0×105個細胞后常規培養。依次將10-5至10-8稀釋的病毒液加入24孔板中，每孔加入100 μL，感染48 h。經免疫組織化學后，在24孔板每孔選擇5個視野，在光學顯微鏡10×物鏡下觀察并計數陽性細胞個數，計算每個孔陽性細胞平均個數及病毒滴度。根據公式病毒滴度(ifu/mL)=(平均視野陽性細胞個數×每孔視野的個數×稀釋倍數)/0.1 mL可計算病毒滴度。

1.2.6Western blot檢測Ad-shRNA-TRPC4有效靶點干擾情況 因TRPC4過表達腺病毒載體包含有Flag基因，因此將293T細胞接種24孔板后，用過表達腺病毒載體和各組干擾質粒共轉染，48 h后收集細胞提取蛋白樣品，用Western blot鑒定已構建的Ad-shRNA-TRPC4是否有效減弱Flag基因的蛋白水平。

1.2.7大鼠EPCs的培養 參照文獻[11]，使用密度梯度離心法分離大鼠骨髓單個核細胞并加入Hyclone的含20%胎牛血清及雙抗的DMEM-L培養基培養，48 h換液，細胞貼壁生長待密度長至70%時備用。

1.2.8Ad-shRNA-TRPC4質粒轉染EPCs 轉染前將EPCs密度調整至70%左右，先用基礎培養液將細胞換液3次，然后用不含血清和雙抗的DMEM-L培養液將Ad-shRNA-TRPC4的病毒液稀釋后進行轉染。4 h后加入新鮮的含20%胎牛血清及雙抗的DMEM-L培養基，48 h可在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞轉染狀況并照相，觀察綠色熒光的細胞占所有細胞的百分比，計算出細胞轉染效率，轉染效率=視野可見的綠色熒光細胞數/總細胞數×100%。因Ad-shRNA-TRPC4帶綠色熒光蛋白(GFP)，用流式細胞儀檢測帶GFP的細胞(即示轉染上Ad-shRNA-TRPC4的細胞)所占比例。

2 結 果

2.1PCR陽性克隆鑒定 用PCR鑒定4組干擾質粒，每組培養后挑取10個轉化子，shRNA-TRPC4(1)組1～5、7～10號轉化子為陽性克隆，shRNA-TRPC4(2)組1～6、8號轉化子為陽性克隆，shRNA-TRPC4(3)組1～6、8～9號轉化子為陽性克隆，shRNA-TRPC4(4)組1～6、8～10號轉化子為陽性克隆。陽性克隆得到343 bp的片段，陰性對照條帶得到307 bp的片段，見圖1。

2.2RNA干擾(RNA interference，RNAi)測序驗證 挑取陽性克隆進行測序，通過測序軟件Chromas分析，所插入的4對shRNA與設計序列完全一致，說明4對目的穿梭質粒shRNA-TRPC4(1)、shRNA-TRPC4(2)、shRNA-TRPC4(3)、shRNA-TRPC4(4)構建成功，見圖2。

1：陰性對照(空載體質粒)；2：DNA Marker，從上到下的方向依次為2 000、1 000、750、500、250、100 bp；3～12：挑取的10個轉化子

圖1菌落PCR鑒定

圖2 shRNA-TRPC4穿梭質粒測序結果

2.3病毒包裝 選取測序正確的shRNA-TRPC4(1)和骨架質粒共轉染HEK293細胞，轉染11 d后觀察，HEK293細胞已大量飄落，細胞基本呈綠色，此時可收集細胞進行病毒貯藏，獲得TRPC4重組腺病毒載體Ad-shRNA-TRPC4，見圖3。

2.4病毒滴度 顯微鏡下5個視野中計算的陽性細胞平均數為7個，此孔病毒稀釋了107倍，得出病毒滴度為5×1010ifu/mL。

2.5各質粒轉染293T細胞的Flag基因的表達 shRNA-TRPC4(1)、shRNA-TRPC4(2)、shRNA-TRPC4(3)、shRNA-TRPC4(4)組Flag蛋白的表達與對照組TRPC4過表達腺病毒載體組比較完全缺如，說明shRNA-TRPC4(1)、shRNA-TRPC4(2)、shRNA-TRPC4(3)、shRNA-TRPC4(4)明顯抑制293T細胞中TRPC4基因的表達。

A:轉染2 d后HEK293細胞；B：轉染7 d后HEK293細胞；C：轉染11 d后HEK293細胞

圖3熒光顯微鏡下轉染后的HEK293細胞(×100)

1：293T陰性對照細胞樣品；2：TRPC4過表達腺病毒載體轉染293T樣品；3～6：shRNA-TRPC4(1)、(2)、(3)、(4)分別與TRPC4過表達腺病毒載體共轉染293T細胞樣品

圖4 Flag在293T細胞中的表達

2.6Ad-shRNA-TRPC4轉染EPCs 用Ad-shRNA-TRPC4(1)轉染EPCs 48 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察，轉染效率為(85.47±2.05)%，見圖5。用流式細胞儀測定帶GFP的細胞占總細胞的比值，Ad-shRNA-TRPC4轉染EPCs效率為(67.27±2.94)%，見圖6。

A：轉染48 h后白光下EPCs；B：轉染48 h后熒光顯微鏡下EPCs

圖5 Ad-shRNA-TRPC4轉染EPCs的代表圖(×100)

A：未經Ad-shRNA-TRPC4轉染的EPCs；B：經Ad-shRNA-TRPC4轉染的EPCs

圖6流式細胞儀測定帶GFP的EPCs細胞水平的代表圖

3 討 論

本研究有兩個重要成果：(1)成功構建TRPC4的shRNA質粒，并進行腺病毒包裝，為后續的細胞實驗及動物模型實驗提供研究基礎；(2)用構建的Ad-shRNA-TRPC4成功轉染體外培養的EPCs，并得到高效率的轉染，為后續實驗提供保障。

血管內皮損傷是動脈粥樣硬化、高血壓等疾病發病的共同環節。血管損傷時，EPCs可從骨髓激活并特異性遷移至損傷血管部位，分化為成熟的內皮細胞,促進損傷血管內皮的修復[12]。鈣離子是細胞重要的第二信使，參與了細胞的增殖、分化、遷移和細胞因子分泌等多種功能的調控[13]，而TRP通道則參與了作為胞外鈣內流途徑之一的鈣庫操縱性鈣通道孔徑的構成。最新研究表明，TRPC4作為TRP通道的重要成員之一，在心血管系統疾病的發生、發展中發揮了重要作用[14]，TRPC4對內皮細胞的功能有重要影響[15]，但TRPC4對內皮細胞的前體細胞EPCs是否有生物學功能影響目前仍不清楚。為完成上述研究，本課題組需沉默TRPC4基因在EPCs的表達，觀察其對EPCs生物學行為影響。目前用于沉默基因表達的常用方法如下：(1)復制基因敲除的動物；(2)構建基因干擾質粒包括siRNA和shRNA干擾質粒。本研究通過RNAi的方法構建沉默大鼠TRPC4基因表達的重組腺病毒載體。RNAi是由內、外源性雙鏈RNA介導的多步驟、多因子參與的過程，可使細胞內mRNA發生特異性降解，導致目的基因有效沉默或抑制[16]。研究表明，siRNA介導的RNAi干擾默靶基因表達的效率低，而shRNA介導的RNAi可以穩定地抑制目的基因的表達，且比化學合成siRNA有更低的成本。目前用于包裝質粒的病毒有慢病毒、腺病毒、腺相關病毒及反轉錄病毒，本實驗選擇腺病毒作為病毒載體，該病毒宿主范圍廣，基因組信息清楚，易操作，容易獲得高滴度，瞬間表達，安全性較高，可感染多種人類細胞。目前較為成熟的載體系統有非復制型(如AdMax)和復制型(又叫溶瘤腺病毒)兩種。本課題組選擇Admax包裝系統，此系統主要利用Cre/loxP(或FLP/frt)重組酶將攜帶外源基因的穿梭質粒與骨架質粒在HEK293細胞中重組，產生重組腺病毒[17]。

綜上所述，本實驗成功構建了shRNA-TRPC4重組病毒載體，實現了高效干擾EPCs中TRPC4表達的目的，為后續研究基因沉默大鼠TRPC4表達對EPCs的生物學功能有何影響奠定了基礎，有助于進一步探索血管損傷后內皮的再生機制。