慢性乙型病毒性肝炎濕熱類證潛在miRNA表達譜研究*

蘇 悅，羅雪梅，彭楊芷，黨思捷，劉西洋，姜 岑△

(1.成都中醫藥大學 610075；2.四川省雅安市中醫院 625000)

慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B，CHB)是HBV持續感染引起的慢性肝臟炎性疾病，病毒性HBV表面抗原(HbsAg)和(或)HBV-DNA持續陽性6個月以上。病毒性肝炎是一項世界性的公共衛生問題，據WHO 2017年報道，全球約有2.57億HBV感染者(HBV表面抗原陽性)，僅2015年，全球HBV及其并發的肝硬化和肝細胞癌等約致88.7萬人死亡。在我國，CHB的發病率也長期居于法定傳染病的前列，國家衛生健康委員會疾病預防控制局(CDC)2017年6月的數據顯示，新增HBV約占新增甲乙類傳染病總數的30.8%，CHB的發病人數及病死率仍處于較高的水平，給社會經濟及人民的健康帶來較為沉重的負擔，深入開展CHB的防治工作仍十分必要。

中醫藥是中華文明的重要載體，數千年來為華夏民族的健康保駕護航，中醫重視“治未病”，在CHB的防治中具有自身的特色和優勢，在準確辨證的前提下遣方用藥，能起到改善患者生存質量，降低肝纖維化的發生，促進肝功能恢復的作用。中醫辨證講究四診合參，但由于CHB證候復雜多變，給辨證帶來了較大難度，尋找客觀的生物學標志物有利于提高辨證的準確性，充分發揮中醫藥防治CHB的優勢。大量研究發現,濕熱類證(脾胃濕熱證、肝膽濕熱證、中焦濕熱證、濕熱內蘊證、脾虛濕熱證等)是CHB的常見證型[1-3]，因此本研究選擇濕熱類證中的脾胃濕熱證、肝膽濕熱證、脾虛濕熱證作為研究對象，篩選其共有的miRNA，探索濕熱類證潛在的表達譜。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究50例患者來源于成都市公共衛生中心及上海中醫藥大學附屬曙光醫院。設脾胃濕熱證組、肝膽濕熱證組、脾虛濕熱證組、無證可辨組、健康對照組，每組各10例。各組年齡、性別等一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2納入標準

1.2.1CHB的納入標準 血清HBsAg陽性至少在6個月以上；病毒載量陽性；1年之內血清學檢查丙氨酸氨基轉移酶(ALT)持續或反復升高；年齡在18～60歲的患者；簽署知情同意書，自愿加入實驗研究，依從性較為滿意者；在試驗進行過程中無計劃遷離當前的試驗地點。符合《慢性乙型肝炎防治指南》(2010年版)[4]的規定，推薦接受抗病毒治療的患者。

1.2.2中醫證型的納入標準

1.2.2.1脾胃濕熱證組 主證：(1)脘腹脹悶；(2)苔黃膩。次證：(1)惡心，厭油，納呆；(2)身目發黃，色澤鮮明或尿黃；(3)大便黏滯臭穢。辨證要求：具備以上所有主證的臨床證素，即屬本證；具備主證(1)及次證(1)、(2)者；具備主證(2)及次證3項中的任何2項者。

1.2.2.2肝膽濕熱證組 主證：(1)脅肋脹痛；(2)舌苔黃膩。次證：(1)納呆嘔惡，厭油膩；(2)身目發黃；(3)尿黃。辨證要求：具備以上所有主證的臨床證素，即屬本證；具備主證(1)及次證3項中的任何2項者，即屬本證；具備主證(2)及次證(1)、(2)者，即屬本證。

1.2.2.3脾虛濕熱證組 主證:乏力；納食減少；舌苔黃。次證:腹脹脘悶；少氣懶言；口苦黏；惡心厭油；四肢倦怠；尿黃；大便干結或溏垢或先干后溏；脈弦數或沉弦。辨證要求：主癥符合 3項，次癥符合1項以上。

1.2.2.4無證可辨組 符合CHB的診斷，但癥狀、體征隱匿，中醫四診難以明辨證型。

1.2.2.5健康對照組 年齡18～60歲，身體質量指數19～24 kg/m2；不嗜煙酒；體格檢查無異常，無心、肺、肝、腎、消化道、代謝異常等病史；女性志愿者排除懷孕、月經期。

1.3排除標準 合并其他類型肝炎病毒和/或HIV感染者；合并肝硬化、惡性腫瘤者；確診為重型肝炎者(含急性、亞急性及慢性重癥肝炎)；合并藥物性或中毒性肝損害、自身免疫性肝炎、遺傳-代謝性肝臟疾病；合并有心、肺、腎、內分泌、血液等嚴重疾病者；懷孕婦女，哺乳期婦女；有精神疾患，符合中國精神障礙分類與診斷(CCMD-3)標準；過敏體質或已知對中藥某些成分過敏的患者；有其他中醫類兼夾證者。符合以上任何1條，均不能納入本臨床研究。

1.4方法 病例納入后，采集清晨空腹肘靜脈全血，進行標本預處理后得到血漿1 mL，由成都博奧獨立醫學實驗室有限公司的專業技術人員進行檢測。本研究采用基因芯片技術，運用Agilent19.0芯片進行檢測，通過對比5組miRNA的表達情況，篩選出差異顯著的miRNA作為CHB 3種濕熱類證的差異miRNA，將這些miRNA在MiRNA Targets Prediction(v2.0 beta)數據庫中(Targetscan、miRDB、TarBase、miRTarBase)預測靶基因，然后將篩選出來的靶基因導入富集分析系統里(數據包為clusterProfiler來自R/bioconductor),采用Fisher精確檢驗，挑選落在相同GO與pathway上的基因數目大于或等于4，P<0.05，富集程度從大到小的前30個結果，以探索差異miRNA的功能。

2 結 果

2.1CHB濕熱類證潛在miRNA表達譜 脾胃濕熱證組與健康對照組、隱證組比較，共篩選出具有顯著差異的miRNA 9條(P<0.05；差異倍數大于2.0)，其中6條表達上調，3條表達下調；肝膽濕熱證組與健康對照組、隱證組比較，共篩選出具有顯著差異的miRNA 14條，均表達上調；脾虛濕熱證與健康對照組、隱證組比較，共篩選出具有顯著差異的miRNA 17條(P<0.05；差異倍數大于2.0)，均為表達上調。hsa-miR-1260a為脾胃濕熱證、肝膽濕熱證、脾虛濕熱證3組共有的miRNA(P<0.05；差異倍數大于2.0)，在各組中均表達上調，見表1。

表1 3組濕熱證hsa-miR-1260a的表達情況

2.2CHB濕熱類證潛在miRNA表達譜的靶基因預測及富集分析結果 本研究共獲得hsa-miR-1260a靶基因3 302條，GO富集分析顯示，其主要與肝素鈉反應、順鉑反應、腎素分泌、上調Wnt信號通路，上調纖維細胞生長因子受體信號通路，正向調節多巴胺的分泌，上調堿性磷酸酶的活性、核包涵體、非膜生成蛋白質酪氨酸磷酸酶活性，負向調節IL-17的生成、血管內皮生長因子激活受體活性、小腦浦肯野細胞分化，活化蛋白激酶活性等具有相關性。

KEGG富集分析結果顯示，hsa-miR-1260a靶基因主要與Wnt信號通路、維生素B6代謝、泛素介導的蛋白水解、甲狀腺癌、內質網的蛋白進程、磷脂酰環己六醇信號系統、其他類O-聚糖的合成、煙酸鹽與煙酸胺的代謝、黏蛋白O-聚糖的合成、黑素生成、賴氨酸退化、亞油酸代謝、肌醇磷酸代謝、肥厚性心肌病、Hedgehog信號通路、粘多糖合成、乙醚代謝、基底細胞瘤、α亞麻酸代謝、脂肪細胞因子通路等具有相關性。

3 討 論

中醫學并無CHB病名，然據其臨床表現，可歸屬于“黃疸”“脅痛”等病的范疇，中醫將CHB的病因概括為濕熱、氣滯、血瘀、正虛等方面，其中“濕熱”最為常見也最為重要。早在《素問》中就提出“濕熱相搏，民病黃疸”，濕性重著，郁久化熱，濕熱膠阻，膽汁不循常道，出于白睛、肌膚、小溲，則發為黃疸；濕熱阻滯氣機，故而脅痛、脘腹脹；濕熱阻滯，脾失健運，而見納差、惡心、厭油；濕熱下注，則出現大便黏膩、小便黃赤；濕熱搏結脈道、上犯于舌，可見脈滑數、舌紅苔黃膩。CHB以濕熱留戀部位的差異，又有脾胃濕熱證、肝膽濕熱證、濕熱內蘊證等，或有素體脾虛，兼受濕熱疫毒外襲所發之脾虛濕熱證，其病因卻均不離“濕熱”二字。因此，筆者以“濕熱類證”概括上述證型，試圖運用現代生物學技術探尋其潛在的生物學本質。

隨著系統生物學、生物信息學的發展，近年來運用現代生物學技術探索中醫證候生物學本質的研究很多，均從不同的角度尋找了證候的生物學標志物，有利于中醫證候理論的深化。如劉暢[5]用代謝組學方法研究濕熱證“異病同證”的物質基礎，發現CHB差異物質27種、非酒精性脂肪性肝病28種、慢性腎小球腎炎24種，3種疾病的濕熱證共同變化的物質為肌苷、鳥苷、天門冬氨酸、油酸甘油酯、乳酸鹽。魏嵋等[6]運用血漿蛋白質組學對CHB濕熱中阻證的研究發現，差異表達蛋白質血清載脂蛋白A1(APO-A1)、載脂蛋白A4(APO-A4)可潛在作為CHB濕熱中阻證診斷、預后標記物及治療靶點。黨思捷等[7]從轉錄組學角度，探索了CHB脾胃濕熱證與肝膽濕熱證生物學基礎的差異。本研究針對濕熱類證中較為常見的脾胃濕熱證、肝膽濕熱證，虛實夾雜性質的脾虛濕熱證進行研究，從miRNA的角度探索濕熱類證的潛在生物學表達譜，是對中醫證候生物學標志物的又一嘗試。

miRNA是一類20～24 nt的非編碼RNA，通過影響mRNA的結構和轉錄功能，參與多細胞器官基因表達的轉錄后調控。miRNA在人體生理、病理過程中發揮重要作用[8]，可作為潛在的診斷標志物[9]。hsa-miR-1260a在既往的研究報道中，有學者發現其在強制性脊柱炎[10]患者中表達下調，在狼瘡腎[11]中表達上調，但這些研究均未涉及中醫證型。本研究發現，hsa-miR-1260a同時存在于CHB典型的3種濕熱證型中，且于各組中FC值存在著差異，說明其在濕熱類證中具有相對的特異性，有助于輔助CHB濕熱類證的診斷及鑒別診斷，對其進行進一步研究也有利于揭示CHB濕熱類證的本質。本研究對hsa-miR-1260a進行靶基因預測，得到3 302條靶基因，功能分析發現其參與調控Wnt信號通路、維生素B6的代謝、肝素鈉反應等，其調控濕熱類證形成的機制仍待進一步的研究。