大豆異黃酮下調TLR4/MyD88介導的信號通路保護心肌肥厚的作用機制*

刁愛芹,王 卉,潘愛萍,李曉潔,周瑞芳,陳國富

(泰州職業技術學院,江蘇泰州 225300)

心肌肥厚是心臟長期負荷過重的一種代償性反應,各種致心肌肥厚因素通過心臟細胞內信號轉導途徑改變相關核轉錄因子的活性，導致心臟組織中大量基因/蛋白質的表達出現異常，是以心臟的形態結構和功能發生變化為特征的心室重構[1]，是多種心血管系統疾病常見的一種并發癥，常導致心力衰竭，如何預防和逆轉心室重構已成為當今治療的重要目標。大豆異黃酮(SI)即大豆苷元是一種異黃酮類化合物，研究發現其具有雌激素樣作用、抗心肌缺血-再灌注損傷作用、抗心衰作用、對過氧化氫誘導的肝細胞損傷的保護作用等[2-4]。周茜等[5]研究表明SI對壓力負荷性大鼠心肌肥厚具有保護作用。本研究采用主動脈弓縮窄(TAC)法致壓力負荷性心肌肥厚模型，探討SI對心肌肥厚的保護作用機制，旨在為SI在心肌肥厚防治中的作用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 清潔級雄性SD大鼠，體質量210～260 g，由揚州大學醫學院實驗動物中心提供。

1.1.2藥品 SI(華北制藥股份有限公司)，異黃酮總含量大于或等于98%，Masson染色試劑盒購自福建邁新生物技術開發有限公司，TLR4抗體、MyD88抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2試驗方法

1.2.1大鼠心肌肥厚模型建立 將大鼠分成4組：假手術組(Sham組)、主動脈弓縮窄模型組(TAC組)、溶劑對照組(TAC+placebo組)和SI治療組(TAC+SI組)。參照文獻[6]方法制備大鼠心肌肥厚模型。3.6%水合氯醛(1 mL/100 g)腹腔麻醉后，經氣管插管與動物呼吸機鏈接。胸部左側第三肋間隙打開胸腔，在左頸總動脈與頭臂干之間穿一0號絲線，并緊貼其上置一10號針頭，用絲線將動脈與針頭一起扎緊并迅速抽出針頭，按照統一標準造成不完全縮窄。假手術對照組除不進行縮窄外，其余手術步驟與其他組相同。TAC+SI組大鼠于造模第2天開始分別灌胃給藥120 mg/(kg·d)，連續4周，TAC+placebo組每天灌胃相同體積的溶劑，藥物臨用時溶于0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶劑中。

1.2.2標本收集和處理 術后4周，末次給藥后禁食12 h大鼠稱質量后處死，取其心臟，去除大血管、心外膜脂肪組織，用生理鹽水清洗，吸干后計算全心質量指數(HW/BW)和左心室質量指數(LVW/TL)。

1.2.3組織學染色 心肌組織膠原及纖維組織的鑒定染色(Masson染色)，取大鼠心臟新鮮組織置于10%甲醛溶液固定，石蠟切片，根據Masson染色試劑盒說明書，進行心肌組織染色，通過光學顯微鏡觀察心肌組織膠原沉積情況。蘇木素(HE)染色，取大鼠心臟新鮮組織置于10%甲醛固定，脫蠟脫水處理。置入HE染核3～5 min，自來水洗5 min共3次，1%鹽酸乙醇分化 0.5～1 min，流水沖洗5 min共3次，氨水反藍1 min，流水沖洗15 min。0.5%伊紅水溶液(對比染色)，95%乙醇、無水乙醇脫水，透明，封固，通過顯微鏡觀察心肌細胞形態。

1.2.4免疫共沉淀(immunoprecipatation，IP) 每組取細胞質蛋白300 μg，用Lysis Buffer補足體積至150 μL，加入TLR4抗體5 μL，4 ℃持續混合過夜后再加入 Protein-A agrose 20 μL，4 ℃充分混合1 h，離心棄上清液。沉淀用Lysis Wash Buffer洗3次，同樣方法離心后再用20 μL的Lysis Buffer混旋沉淀，加4 μL 6×SDS Loading Buf,煮沸3 min后收集上清液Western blot方法分析MyD88及TLR4蛋白表達水平。

2 結 果

2.1SI對TAC術后心臟外觀變化 從圖1可見，雄性SD大鼠進行TAC后4周，其心臟發生明顯肥大，與Sham組相比，HW/BW和LVW/TL的值顯著升高(t=4.344,P=0.012 2和t=8.762,P=0.000 9,n=6)；TAC+placebo組HW/BW和LVW/TL與TAC組比較差異無統計學意義(t=0.222 7,P=0.834 7和t=0.519 6,P=0.630 8,n=6)，與Sham組比較明顯升高(t=3.375,P=0.027 9和t=6.640,P=0.002 7，n=6)；而TAC+SI組心臟大小與TAC組相比，HW/BW和LVW/TL的值顯著降低(t=3.432,P=0.026 5和t=5.738,P=0.105，n=6)。

圖1 TAC誘導的雄性SD大鼠的心室肥大

A:各組HW/BW比較;B:各組LVW/TL比較;*：P<0.05，與Sham組比較；#：P<0.05，與TAC組、TAC+placebo組比較

圖2 TAC誘導的SD大鼠心臟質量改變

圖3 TAC后4周心肌組織的形態學改變(HE×400,Masson×100)

2.2SI對TAC術后心肌形態學和心肌纖維化變化 與Sham組比較，TAC組的心肌組織細胞間隙中的纖維結締組織明顯增多。使用SI處理4周的TAC+SI組，心肌組織內纖維結締組織與 TAC組相比則明顯減少，TAC+placebo組心肌組織內膠原含量與TAC組相比則沒有明顯改變。對左心室心肌組織進行常規切片，Sham組心肌結構正常，TAC組心肌細胞直徑增寬，肌纖維排列紊亂。使用SI治療4周后，心肌細胞橫截面積減小，而TAC+placebo組4周后的心肌細胞橫截面積仍顯著增加，肌纖維排列紊亂。見圖3。

A:Western blot圖;B：TLR4和MyD88蛋白相互結合統計分析;*：P<0.01，與Sham組比較；#：P<0.01與TAC組、TAC+placebo組比較；IP：免疫共沉淀；IB：Western blot檢測

圖4 SI抑制TAC引起的大鼠心臟TLR4對MyD88相互作用

2.3SI抑制 TAC引起的TLR4對MyD88招募的增加 TAC后4周，TAC組大鼠左心室心肌組織TLR4與MyD88的結合與Sham組相比明顯增加(t=16.07,P=0.003 9,n=6)；TAC+placebo組與TAC組比較無明顯變化(t=1.761,P=0.220 2,n=6)，給予SI治療后，TAC后4周心室心肌組織TLR4與MyD88的結合與TAC+placebo組顯著降低(t=13.88,P=0.005 1,n=6)。見圖4。

3 討 論

TAC可引起大鼠壓力超負荷性心肌肥厚和心室重構。本實驗模型組的心臟質量指標(HW/BW和LVW/TL)明顯增加、Masson染色和HE染色顯示的形態學指標均高于Sham組，SI治療后可抑制心臟質量及形態學指標，說明SI可減輕TAC所致的大鼠心肌肥厚。

SI是大豆生長形成的一類次生代謝產物，它包括15種結構類似的化合物，主要包括染料木黃酮、大豆素苷元和大豆苷元等，其中燃料木黃酮的活性最高。SI的結構與雌激素相似，在體內它可以與雌激素受體結合發揮弱的雌激素樣作用而不攜帶雌激素的不良反應，被認為是天然的雌激素替代品。流行病學研究證實SI在女性心血管疾病的發病和預防治療中起重要作用[2，6]。也有研究表明，SI對腹TAC所致心肌肥厚大鼠心室重構有一定的保護作用，然而具體的作用機制還不是很清楚，從而限制了臨床應用SI治療或預防心血管疾病[5]。

Toll樣受體是天然免疫系統內重要的模式識別受體。在這些受體中，TLR4可被內毒素、熱休克蛋白60、纖維連接素等多種外源性或內源性配基激活，招募髓樣分化蛋白88(MyD88)，誘導MyD88下游的核轉錄因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)與 NF-κB的抑制蛋白IκBα(inhibitor of NF-κB)解離，進入細胞核內，編碼不同肥大基因的轉錄活化及炎癥因子的產生，增強心肌細胞的肥大程度及凋亡。TLR4信號通路的激活源于細胞質TIR域，在LPS等配基的刺激下，TLR4通過TIR域與MyD88的TIR域相結合，MyD88被激活后，通過死亡域招募下游的IL-1受體相關激酶(IRAKs)，誘導下游的兩條不同的信號通路，最終分別激活c-Jun氨基末端激酶和NF-κB，其中，NF-κB進入核內參與調控基因的表達。這些改變可能誘導心肌細胞的病理性肥大及細胞色素c的缺失等細胞表型的改變。文獻[7-8]研究發現TLR4/MyD88介導的NF-κB信號通路在壓力負荷增加或纖維蛋白原誘導心肌肥大過程中發揮重要作用，TLR4基因缺陷小鼠與對照組相比，TAC誘導的心肌肥大的程度與野生型小鼠相比明顯減輕；而心肌局部轉染MyD88無效抑制因子(Ad5-dn-MyD88 )特異性抑制MyD88信號轉導亦能夠明顯減少TAC或纖維蛋白原誘導的心肌肥大發生、發展過程中NF-κB的活化，減輕心肌肥大，改善心臟功能。

有資料表明，天然雌激素對心肌肥大具有保護作用，并且能降低LPS誘導的H9C2心肌細胞系中的TLR4 mRNA的表達[9-11]。另外有研究發現,在表皮角質細胞中，天然雌激素可以降低創傷性出血誘導的TLR4與MyD88的蛋白表達水平及下游的信號級聯反應[12-13]。LOU等[14]研究表明在脫膜間質細胞中雌激素能下調LPS激活的TLR4信號通路發揮抗炎抗凋亡作用，這些研究結果提示天然雌激素可能通過影響TLR介導的信號通路發揮其免疫保護作用。SI作為天然雌激素的替代品，在本實驗中發現SI能抑制TAC誘導的大鼠心肌組織內TLR4/MyD88交互作用增加，從而影響下游信號通路，抑制TAC誘導的心肌肥大的發生、發展。

綜上所述，SI可抑制壓力超負荷導致的心肌肥厚和心室重構，而這種作用可能與抑制TLR4/MyD88介導的心肌肥厚信號通路有關，有關作用機制還有待深入研究。