葛黃顆粒含藥血清對(duì)乙醇誘導(dǎo)L-02肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究*

付 裕,郎 涵，陳柚伶，仁德芳,王洪連，魏 嵋，王曉棟，李 志

(1.西南醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，四川瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院脾胃科，四川瀘州 646000；3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合防治器官纖維化實(shí)驗(yàn)室及中西醫(yī)結(jié)合研究中心，四川瀘州 646000；4.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院肝膽內(nèi)科，四川瀘州 646000)

酒精性肝病(ALD)是我國(guó)常見的肝臟疾病之一，是長(zhǎng)期大量飲酒所導(dǎo)致的一類疾病，嚴(yán)重危害人民身體健康。近年來(lái)ALD發(fā)病率越來(lái)越高。肝細(xì)胞凋亡在各種肝臟疾病中常常出現(xiàn)，其中Fas/Fas 配體(Fas Ligand,FasL)通路是當(dāng)前最重要的一條主導(dǎo)途徑，發(fā)揮十分關(guān)鍵的作用。許多資料表明，在非酒精性脂肪性肝病的發(fā)展中Fas/FasL途徑有著極其重要的影響，然而其在酒精性肝損傷的進(jìn)程中所具有的影響和機(jī)制尚未闡明[1-3]。目前ALD的治療方法及藥物較少，研發(fā)治療ALD的新藥是亟待解決的問(wèn)題。本研究采用的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪且掖颊T導(dǎo)的L-02肝細(xì)胞損傷模型，研究中應(yīng)用葛黃顆粒含藥血清來(lái)進(jìn)行系列干預(yù)，并研究和分析Fas/FasL系統(tǒng)及其相關(guān)基因表達(dá)的情況，以期發(fā)現(xiàn)葛黃顆粒防治ALD的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞系 健康雄性SD大鼠共60只，質(zhì)量180～220 g，由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。人正常肝細(xì)胞L-02，由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究中心提供。

1.1.2藥物 葛黃顆粒藥物構(gòu)成：葛花、柴胡、趕黃草、虎杖、丹參、枳椇子等。將原生藥制作成深褐色流浸膏以利于灌胃，2 g原生藥可制作成1 mL流浸膏。由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供。生產(chǎn)批號(hào)20150504。美他多辛片，由山東齊都藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格每片0.5 g。生產(chǎn)批號(hào)1402002。

1.1.3試劑 RPMI-1640購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；CCK8購(gòu)自同仁化學(xué)研究所；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)及細(xì)胞凋亡試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertTra Ace qPCR RT Master Mix)購(gòu)自日本 Tokoyo公司。Fas引物:上游5′-ATAAGCCCTGTCCTCCAGGT-3′，下游5′-GTTGCTGGTGAGTGTGCATTT-3′；FasL引物:上游5′-AGAGAGGGAACCACAGCACA-3′,下游5′-TGCCAGCTCCTTCTGTAGGT-3′；caspase8引物:上游5′-TCTGTGCCCAAATCAACAAG-3′，下游5′-GCTCTTCAAAGGTCGTGGTC-3′；caspase3引物:上游5′-AAATGGACCTGTTGACCTGA-3′，下游5′-CACAAAGCGACTGGATGAAC-3′；內(nèi)參18S：上游5′-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3′，下游5′- CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3′。

1.2方法

1.2.1葛黃顆粒含藥血清的制備 雄性SD大鼠60只(180～220 g)，喂養(yǎng)1周后，分為空白對(duì)照組、葛黃顆粒組及美他多辛組，3組各20只，均給予一般飼料喂養(yǎng)。含藥血清制備給藥劑量參照《動(dòng)物與人體的每千克體重劑量折算系數(shù)表》及李儀奎[4]提出的相關(guān)理論，最終用藥劑量為葛黃顆粒組(3.1 g·100 g-1·d-1)、美他多辛組(0.1 g·100 g-1·d-1)、空白對(duì)照組(等體積蒸餾水)，每天早、晚灌胃給藥各1次，連續(xù)灌胃5 d。最后一次灌胃前禁食12 h，但不禁水，在最后一次灌胃給藥1 h后，采用2%戊巴比妥鈉(0.3 mL·100 g-1)腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，離心轉(zhuǎn)速3 000 r/min，離心10 min后將上層血清吸取出來(lái)，同組血清合并歸放，將收集的血清放置于56 ℃恒溫水浴箱中滅活30 min，過(guò)濾除菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 將L-02肝細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37 ℃ 、5% CO2、濕度95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3乙醇作用濃度的確定 通過(guò)參考文獻(xiàn)[5]，將L-02肝細(xì)胞以每毫升1×105個(gè)接種于96孔板,待細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)液為10%胎牛血清和含不同濃度 (0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、5.0%)乙醇的培養(yǎng)液,將不含乙醇組設(shè)為對(duì)照組。于6、12、24 h后，分別將96孔板中的培養(yǎng)基全部吸出，然后在96孔板中加入濃度為10% CCK-8的不含胎牛血清的培養(yǎng)基后，再分別于30 min、1、2、4 h不同時(shí)間段，將酶標(biāo)儀數(shù)值設(shè)定在450 nm處檢測(cè)各孔的吸光值，然后計(jì)算L-02肝細(xì)胞活力。每個(gè)小組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。最后根據(jù)L-02肝細(xì)胞的活力選擇出最合適的乙醇濃度。

1.2.4造模時(shí)間的確定 用含0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、5.0%不同濃度的乙醇作用于L-02肝細(xì)胞，再分別于6、12、24 h不同時(shí)間點(diǎn)收集L-02肝細(xì)胞上清液，最后用于測(cè)定AST、LDH水平。根據(jù)AST、LDH水平的高低，同時(shí)結(jié)合L-02肝細(xì)胞活力最終確定細(xì)胞造模的最佳時(shí)間。

1.2.5細(xì)胞模型的建立和分組 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將L-02肝細(xì)胞配制成每毫升2×105個(gè)的細(xì)胞懸液，并將其接種于6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后分為6組，正常組、模型組、葛黃顆粒低、中、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組，正常組加入10%正常大鼠血清，模型組在上述基礎(chǔ)上加入3%乙醇，葛黃顆粒低、中、高劑量組分別加入3%乙醇、不同濃度(1.25%、2.5%、5%)葛黃顆粒含藥血清及(8.75%、7.5%、5.0%)正常大鼠血清，陽(yáng)性對(duì)照組則加入3%乙醇、5%美他多辛含藥血清及5%正常大鼠血清。然后再培養(yǎng)24 h后，將L-02肝細(xì)胞及上清液收集用于后續(xù)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.6觀察指標(biāo)及方法 采用日本Olympus公司AU 2700全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)細(xì)胞上清液AST、LDH水平。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，使用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)Fas、FasL、caspase3、caspase8 mRNA的表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1乙醇作用濃度的確定 當(dāng)乙醇濃度為3.0%時(shí)，各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活力均大于75%(P<0.05)，鏡下觀察肝細(xì)胞體積稍增大,懸浮的細(xì)胞較對(duì)照組增多。見表1。

2.2乙醇作用時(shí)間的確定 當(dāng)乙醇濃度為3.0%時(shí)，作用時(shí)間為24 h時(shí)AST、LDH水平最高(P<0.05)。見表2。

2.3乙醇誘導(dǎo)L-02肝細(xì)胞損傷模型的建立 模型組鏡下顯示，用含濃度為3.0%乙醇的培養(yǎng)液培養(yǎng)L-02肝細(xì)胞24 h后，其L-02肝細(xì)胞體積變大，懸浮未貼壁的細(xì)胞與正常組相比增多。見圖1。

2.4各組細(xì)胞上清液AST、LDH水平的比較 模型組的AST、LDH水平均較正常組顯著增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，高、中、低劑量組的 AST、LDH水平均有不同程度的下降，且隨著劑量越高，下降幅度越大。中、高劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，陽(yáng)性對(duì)照組AST、LDH水平較模型組更低(P<0.05)。陽(yáng)性對(duì)照組和中劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，陽(yáng)性對(duì)照組和高劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表1 不同濃度乙醇對(duì)L-02肝細(xì)胞6、12、24 h CCK8檢測(cè)結(jié)果的影響

表2 不同濃度乙醇作用于L-02肝細(xì)胞6、12、24 h后AST、LDH水平

a：P<0.05，與乙醇濃度0%比較

A：正常組；B：模型組

圖1乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷模型(×400)

表3 各組細(xì)胞上清液AST、LDH水平的比較

a：P<0.05，與正常組比較；b：P>0.05，c：P<0.05，與模型組比較；d：P<0.05，e：P>0.05，與陽(yáng)性對(duì)照組比較

2.5L-02肝細(xì)胞凋亡的比較 從肝細(xì)胞凋亡率分析，與正常組比較，模型組L-02肝細(xì)胞凋亡率明顯升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。陽(yáng)性對(duì)照組和模型組相比，均明顯降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組L-02肝細(xì)胞凋亡率和模型組相比明顯下降(P<0.05)。陽(yáng)性對(duì)照組和中劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，陽(yáng)性對(duì)照組與高劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 見圖2。

2.6各組L-02肝細(xì)胞的Fas、FasL、caspase3、caspase8 mRNA表達(dá)水平的比較 模型組中Fas、FasL、caspase3、caspase8 mRNA表達(dá)水平和正常組相比，以上指標(biāo)均明顯升高(P<0.05)。陽(yáng)性對(duì)照組和模型組相比，上述指標(biāo)均明顯降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高、中、低劑量組上述指標(biāo)均下降，且隨劑量的高低不同呈現(xiàn)出正相關(guān)，中、高劑量組和模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。陽(yáng)性對(duì)照組和中劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，陽(yáng)性對(duì)照組和高劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

圖2 流式細(xì)胞檢測(cè)各組L-02肝細(xì)胞凋亡

表4 各組細(xì)胞的Fas、FasL、caspase3、caspase8 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較

a：P<0.05，與正常組比較；b：P>0.05，c：P<0.05，與模型組比較；d：P<0.05，e：P>0.05，與陽(yáng)性對(duì)照組比較

3 討 論

ALD是因長(zhǎng)期大量飲酒所引起的肝臟損害的一系列疾病。隨著我國(guó)酒文化的快速發(fā)展，使ALD患者數(shù)量逐漸的上升，但是當(dāng)前還缺乏較好的治療手段，且ALD發(fā)病機(jī)制仍不明確。較多研究者認(rèn)為ALD的發(fā)生可能與肝細(xì)胞凋亡有關(guān)。肝細(xì)胞凋亡是引起各種肝臟疾病及肝臟損傷的非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，所以有效降低其凋亡發(fā)生率將有可能成為一種防治肝臟疾病的重要方法[6]。許多研究表明，細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外凋亡途徑是引發(fā)細(xì)胞凋亡的最主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[7]。NEPAL等[8]研究發(fā)現(xiàn)Fas/FasL系統(tǒng)通路是細(xì)胞外凋亡途徑中引起肝細(xì)胞凋亡最關(guān)鍵的一環(huán)，雖然Fas/FasL通路是細(xì)胞外凋亡途徑，然而可以同時(shí)通過(guò)細(xì)胞內(nèi)外途徑激活效應(yīng)分子caspase-3，caspase-3又能激活下游的相關(guān)基因而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。美他多辛片是現(xiàn)在臨床治療ALD的主要藥物，但是具有很多的不良反應(yīng)，并且價(jià)格較高，所以急需研發(fā)出治療該病的其他藥物。中藥與西藥相比價(jià)格低廉，不良反應(yīng)少，可多途徑、多靶點(diǎn)對(duì)機(jī)體各方面起到療效，大量研究表明中醫(yī)藥在治療ALD方面具有顯著的效果[9-10]。大部分醫(yī)家學(xué)者認(rèn)為ALD的基本病機(jī)為肝膽不暢，以致疏泄失常。本病多因酒食無(wú)制，內(nèi)損脾胃，脾胃失于運(yùn)化水濕，濕濁積聚，蘊(yùn)而化熱，以致濕熱內(nèi)蘊(yùn)，郁于肝膽，肝膽失于疏泄，氣機(jī)內(nèi)阻，繼而血瘀內(nèi)停，從而導(dǎo)致以肝臟損傷，同時(shí)波及其他多臟腑。葛黃顆粒是西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院全國(guó)名老中醫(yī)孫同郊教授在其長(zhǎng)時(shí)間治療ALD的經(jīng)驗(yàn)之中整理歸納的經(jīng)驗(yàn)方“葛黃解酒方”，主要有葛花、柴胡、趕黃草、虎杖、丹參、枳椇子等，主要功效為醒酒解毒、清熱利濕、健脾疏肝。本方就是依據(jù)上述的基本病機(jī)化裁而來(lái)，在臨床實(shí)際運(yùn)用當(dāng)中效果顯著。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)葛黃顆粒對(duì)ALD的防治作用[11]。本研究是基于細(xì)胞層面對(duì)其防治ALD進(jìn)一步探究，這對(duì)完善其治療依據(jù)有極為關(guān)鍵的作用。

本實(shí)驗(yàn)參考大量相關(guān)文獻(xiàn)研究，同時(shí)結(jié)合CCK8檢測(cè)的L-02肝細(xì)胞活力結(jié)果及不同時(shí)間段上清液AST、LDH水平，最終成功建立3%乙醇干預(yù)24 h誘導(dǎo)的體外肝細(xì)胞損傷模型。(1)當(dāng)細(xì)胞損傷、凋亡或死亡時(shí)，會(huì)引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性受到破壞，從而造成細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的AST、LDH進(jìn)入到細(xì)胞外[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示葛黃顆粒含藥血清具有保肝降酶的功效，且該功效和含藥血清的體積比呈現(xiàn)正相關(guān)。(2)長(zhǎng)時(shí)間攝入酒精，會(huì)促進(jìn)肝臟、胃黏膜等細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，并且在酒精性肝損傷發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程之中，始終有肝細(xì)胞凋亡的存在[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明葛黃顆粒含藥血清能有效地降低肝細(xì)胞凋亡率，且降低肝細(xì)胞凋亡率與含藥血清的體積比呈正相關(guān)。(3)很多研究表明，在凋亡途徑之中，死亡受體途徑是一個(gè)極其關(guān)鍵的途徑，是指配體與死亡受體結(jié)合之后造成的凋亡，而主要的配體有FasL等。Fas和配體FasL結(jié)合后，激活下游的效應(yīng)分子caspase8、caspase3，引發(fā)逐級(jí)活化，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究表明葛黃顆粒含藥血清可以減少L-02肝細(xì)胞凋亡，其主要的機(jī)制或許是抑制Fas/FasL途徑和其下游效應(yīng)因子相關(guān)。

綜上所述，葛黃顆粒含藥血清能夠抑制Fas/FasL途徑及其下游效應(yīng)因子的活化，發(fā)揮防治ALD的作用。因此，通過(guò)抑制Fas/FasL途徑及其下游效應(yīng)因子的活化或許是葛黃顆粒治療ALD的重要機(jī)制之一。